低共熔溶剂提取核桃青皮多酚工艺优化及其抑菌活性

汪 涛，梁 亮，李旭锐，胡雪芳，孙君社，裴海生

低共熔溶剂提取核桃青皮多酚工艺优化及其抑菌活性

汪 涛，梁 亮，李旭锐，胡雪芳，孙君社，裴海生※

（1. 农业农村部规划设计研究院，北京 100121；2. 农业部农产品产后处理重点实验室，北京 100121）

为了充分利用核桃副产物，减少环境污染，该研究以核桃青皮为研究对象，分别采用不同pH值（3、7、10）水溶液、50%乙醇溶液和低共熔溶剂（尿素/氯化胆碱：DES-UC，草酸/氯化胆碱：DES-OC）提取多酚。首先在温度80 ℃、液料比25 mL/g、低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents, DESs）配位剂摩尔比1.0的条件下提取60 min筛选出DES-OC提取效果较好；随后在单因素试验考察的基础上，采用响应面分析法确定了DES-OC提取核桃青皮多酚的优化工艺参数：草酸/氯化胆碱摩尔比1.0、温度85 ℃、时间62 min、液料比50 mL/g，在此条件下多酚提取量为50.87 mg/g。另外，通过对核桃青皮多酚提取混合溶剂抑菌活性试验的研究，发现DES-OC与核桃青皮多酚混合后对大肠杆菌（）的抑菌效果较佳，金黄色葡萄球菌（）次之，最后为黄青霉（）。以上试验结果可为研究开发天然抑菌剂、保鲜剂等提供理论基础，拓宽核桃青皮加工利用途径的同时也为提取农产品副产物中生物活性成分提供新思路。

提取；优化；低共熔溶剂；核桃青皮；多酚；抑菌活性

0 引 言

核桃（L），又名胡桃，为胡桃属植物中经济价值最高的树种之一。中国核桃种植面积居世界首位，同时核桃品种多、资源丰富。但核桃青皮却未得到充分利用，长期以来，作为废渣丢弃，造成了极大的环境污染和资源浪费[1-2]。核桃青皮中富含多酚物质，如绿原酸、香草酸、槲皮素、没食子酸、核桃酮等，有很强的抑菌、抗衰老、降血脂、抗癌、抗辐射等生理功效，且能有效减少氧化应激和抑制大分子氧化[3-5]。目前已成为食品、医药、染色等行业研究的热点课题之一，充分开发利用核桃青皮中丰富的多酚资源极具前景和意义，不仅能减少环境污染，而且能带来一定的社会经济效益。

多酚易溶于极性大的溶剂，如水、乙醇、丙酮，可溶于乙酸乙酯，不溶于乙醚、氯仿、石油醚等。目前核桃青皮多酚提取技术主要集中在有机溶剂、离子沉淀、树脂吸附分离、超临界二氧化碳萃取、超声浸提、微波浸提等方法。如张春媛[6]应用螯合剂六偏磷酸钠协同微波双辅助得到提取量为41.2 mg/g的核桃青皮多酚；刘迪等[7]应用超临界二氧化碳萃取技术在温度50 ℃、压力30 MPa、时间6 h、75%乙醇溶液、夹带剂用量3.0 mL/g、CO2流量30 kg/h，提取量可达88.3 mg/g。但美中不足的是这些工艺过程存在能耗大、效率低、价格昂贵和污染环境等诸多问题，因此，提取核桃青皮多酚非常需要能使细胞壁结构松弛的绿色且廉价的溶剂。最近，提出了一种称为低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents，DESs）的新型绿色溶剂，作为生物质加工的介质[8]。DESs是由氢受体/氢供体组成，按合适比例混合加热（80～100 ℃）形成的液态混合溶剂，其凝固点比配位剂都要低，具有不易挥发、价格低、毒性小、可回收利用、绿色环保、易制备不需纯化等优势，是广泛使用的新型绿色溶剂之一[9]。根据配位剂的性质可以将DESs分为3种类型：Ｉ类由季铵盐和氯化物（MClx）形成，该类与金属卤化物/咪唑盐体系类似；Ⅱ类由水合金属卤化物与氯化胆碱形成；Ⅲ类由氢受体与氯化胆碱组成，氢受体通常是酰胺、羧酸或醇[10]。Ⅰ、Ⅱ类因含有金属离子属性不适合在农业副产物方面的应用，本文主要研究Ⅲ类低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents, DESs）。Tang等[11]应用DESs提取白柏中黄酮，与传统热水浸提相比，槲皮素、杨梅素和穗花杉双黄酮提取率分别增加了128.7%、111.7%、111.1%。Chanioti等[12]选取DESs中柠檬酸/氯化胆碱（DES-AC）和乳酸/胆碱氯化物（DES-AL）分别提取橄榄渣中酚类化合物，发现DES-AC所提取的总酚含量和抗氧化活性均高于均质化、微波、超声波和高静水压力辅助等方法。DESs的回收利用是提取植物活性物质的优势之一，如熊苏慧等[13]利用醋酸钠和乳酸合成的NADESs提取玉竹中的黄酮提取量为20.13 mg/g，回收利用一次提取量仍有18.79 mg/g；Zhang等[14]重复利用DES-OC六次茯苓多糖的提取率为38.40％，较传统的热水提取提高了7.2倍。但是由于核桃青皮成分中富含醌类物质的特殊性，DESs的回收利用是未来需要突破的关键技术之一。DESs黏度低有很好的渗透能力，呈弱酸性有辅助分解植物细胞壁木质素、半纤维素及纤维素的作用[15]，使活性成分的溶出率增加。研究发现核桃青皮多酚对细菌和真菌有很强抑制能力，同时DESs也有一定的抑菌性，可为其在食品保鲜领域的应用提供理论依据[16]。

本文使用DESs为溶剂探究对核桃青皮多酚的提取效果，优化提取较佳效果的条件：氢受体/氢供体摩尔比、温度、时间及液料比，旨在提高多酚提取效果，为有效利用核桃青皮及拓展DESs应用领域提供理论支撑。此外，通过核桃青皮多酚与DESs混合溶剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黄青霉的抑菌活性研究，为开发天然保鲜剂提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

核桃青皮粉：本实验室自制。采摘7月中下旬的青皮棉核桃，取其青皮，60 ℃烘干、粉碎，粒度为4.0 mm，防潮、冷藏条件下保存（温度4 ℃，相对湿度0～5%），备用。

氯化胆碱，上海国药控股化学试剂有限公司；尿素、草酸、福林酚试剂、甲醇，国药集团化学试剂有限公司；无水碳酸钠、浓盐酸盐，北京化工厂；氢氧化钠，国家化学试剂质检中心；没食子酸，北京百灵威科技有限公司；LB培养基、PDA培养基，青岛海博览生物技术有限公司；吐温80，青岛优索化学科技有限公司。

金黄色葡萄球菌（）、大肠杆菌（）、黄青霉（），中国科学院。

1.2 试验仪器

UV-1780型紫外可见分光光度计，岛津仪器（苏州）有限公司；GM-0.5型隔膜真空泵，天津市津腾实验设备有限公司；HWS-26型电热恒温水浴锅，苏州江东精密仪器有限公司；AR223CN型电子天平，奥豪斯（常州）仪器有限公司；BCN-1360型生物洁净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；NDJ-1B旋转黏度计，上海昌吉地质仪器有限公司；HZQ-C型空气浴振荡器，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；LDZX-50KBS立体式高压灭菌器，上海申安医疗器械厂；HS-250A恒温恒湿培养箱，南京恒裕电子仪器厂；XSP-SM4型双目生物显微镜，上海谱骞光学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 核桃青皮多酚提取与测定

分别用酸性（pH值为3）、中性（pH值为7）、碱性（pH值为10）水溶液、50%乙醇溶液、DESs（尿素/氯化胆碱：DES-UC，草酸/氯化胆碱：DES-OC；配位剂摩尔比1.0）提取核桃青皮多酚。称取1.0 g核桃青皮粉，在温度80 ℃、液料比25 mL/g的条件下提取60 min，待提取结束后，迅速降温终止反应，真空（0.1 MPa）抽滤，收集滤液，定容。

精确称取0.1 g没食子酸溶于70%甲醇配置成1 000g/mL标准储备液，分别取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL液于100 mL容量瓶定容，浓度分别为10、20、30、40、50g/mL。吸取没食子酸工作液、蒸馏水（空白对照）、待测液于1.0 mL刻度试管，分别加入5.0 mL 10%福林酚试剂，摇匀。室温反应5.0 min，加入4.0 mL 7.5%碳酸钠溶液，摇匀室温放置60 min，在765 nm波长条件下测定吸光度[17]。以吸光度值为纵坐标，标准没食子酸质量浓度（g/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得出回归方程为=0.001+0.006，2=0.999，线性相关性良好。根据标准曲线计算出多酚质量浓度，进而计算核桃青皮中多酚的提取量（mg/g），按下列公式计算：

式中为多酚质量浓度，g/mL；为多酚溶液体积，mL；为稀释倍数；为样品干质量，g。

1.3.2 单因素试验

分别选取草酸/氯化胆碱摩尔比（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5）、温度（60、70、80、90、100 ℃）、时间（15、30、45、60、75、90、105、120 min）和液料比（10、20、30、40、50 mL/g）进行单因素变量替换工艺流程中相应的常规量，考察各因素对多酚提取效果的影响，以上每个处理均重复3次。

其中，探究草酸/氯化胆碱摩尔比对核桃青皮多酚提取效果的影响，需测定室温（25 ℃）条件下的黏度，综合考虑实际生产的实用性。

1.3.3 响应面优化试验

在单因素试验的基础上，确定草酸/氯化胆碱摩尔比为1.0，利用响应面分析法对其余3个因素进一步优化。根据Box-Behnken试验设计原理，选取温度（1）、时间（2）及液料比（3）为自变量，以核桃青皮多酚提取量为响应值（1），进行三因素三水平的响应面分析，优化多酚的提取工艺，试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平

1.3.4 核桃青皮多酚抑菌活性试验

用三点接种法将黄青霉（）接种到PDA培养基上28 ℃培养48 h后，用含有0.1%吐温80的无菌水将孢子从PDA平板洗下，震荡均匀，调整孢子悬浮液浓度为1.0×107孢子/mL，菌悬液现用现配。

分别吸取上述制备的菌悬液、孢子悬浮液0.02 mL接种到LB琼脂培养基、PDA培养基涂布均匀，采用直径为6.0 mm的无菌打孔器，打3个孔P1、P2、P3，分别加入0.05 mL无菌水、DES-OC（100%）、DES-OC-青皮多酚（100%），培养24 h，培养48 h后，用十字交叉法测量抑圈圈直径，每个处理重复3次，取平均值为菌落直径。抑菌圈直径=菌落直径平均值－菌块直径。

分别将DES-OC-青皮多酚稀释成0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mg/mL的系列溶液，按上述方法测定不同浓度DES-OC-青皮多酚的抑菌圈直径。

1.4 数据处理

试验重复3次，采用Design Expert 8.0.6响应面设计软件、Origin 2017和SPSS 19软件对试验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂对核桃青皮多酚提取效果

根据DESs价格低、毒性小、绿色环保、易制备等特性，选择DES-UC、DES-OC作为研究对象，与酸性（pH值为3）、中性（pH值为7）、碱性（pH值为10）水溶液及50%乙醇溶液对核桃青皮多酚的提取效果进行比较。结果如图1所示，提取核桃青皮多酚由多到少的溶剂依次为DES-OC、DES-UC、酸性（pH值为3）水溶液、50%乙醇溶液、中性（pH值为7）水溶液、碱性（pH值为10）水溶液。

注：固定因素条件为温度80 ℃、液料比25 mL·g-1、DESs配位剂摩尔比1.0、时间60 min，上标不同字母表示在=0.05水平显著差异。

Note: The fixed factor conditions are temperature:80 ℃, liquid to solid ratio: 25 mL·g-1, DESs complexing agent molar ratio: 1.0, time : 60 min .

Different superscript letters indicate significant differences at=0.05 level.

图1 溶剂对核桃青皮多酚提取效果的影响

Fig.1 Effects of extraction solvent on the extraction effects of walnut green husk polyphenols

在温度80 ℃、液料比25 mL/g、DESs配位剂摩尔比1.0的条件下提取60 min条件下下DESs提取多酚的效果相对较好，与其独有的理化性质密不可分，DESs几乎都是带正负电荷的盐离子，有很强的作用力溶于细胞间或破坏细胞膜结构，易于多酚渗透和扩散[18]。DESs配位剂组成会显著影响植物活性物质的溶出，配置合成不同组分的混合物，其理化性质有较大的差异，根据试验结果，选择DES-OC作为后续的研究对象。

尾声重新回到了乐章的开头（第220至245小节）。但是，它是在Ⅳ级和弦上，通过半音上升，回到主和弦（第235小节），此时给人一种似乎又要继续下去的感觉，然后，突然地以四个小节在弱拍上的突强音结束。

2.2 DES-OC提取核桃青皮多酚单因素试验结果分析

2.2.1 草酸/氯化胆碱摩尔比对核桃青皮多酚提取效果的影响

由图2a可知，随着草酸/氯化胆碱摩尔比的增加，多酚提取量呈连续降低的趋势。DESs具有分子结构可设计的特点，氢供体/氢受体摩尔比的大小变化，使DESs极性、黏度、pH值等理化性质有了相应的差异，从而影响多酚的提取效果[19]。其中，DESs的黏度对多酚提取效果有显著的影响（<0.05），由图3可知，在草酸/氯化胆碱摩尔比在0.5～2.5范围内，DES-OC的黏度变化较大呈先降低后上升的趋势。DES-OC黏度降低，传质效果得到相应的改善，增加了多酚在溶剂中的扩散系数；相反，黏度过高，导致能量传递缓慢，严重阻碍多酚从细胞传质到溶剂介质中的效率。另外，高黏度的DES-OC会导致后续多酚的分离、纯化和浓缩等下游技术的困难，增加运营成本，影响实际应用。综合考虑，选取草酸/氯化胆碱摩尔比1.0作为后续研究的参数。

2.2.2 温度对核桃青皮多酚提取效果的影响

由图2b可知，温度对核桃青皮多酚提取效果有显著影响，随温度的升高呈先增加后降低的趋势，在80 ℃时达到最大。提高温度降低DES-OC的黏度加速分子运动，使多酚更易于从细胞内部扩散到溶剂中进而提高多酚的提取效果；但当高于临界温度80 ℃时，由于多酚化学结构不稳定，温度过高易发生降解。另外，核桃青皮中的多糖、蛋白、果胶等活性物质溶出增加，使溶剂相对浓度差减小，黏度增大，不利于多酚从细胞溶出[20-21]。综合考虑，选取70、80、90 ℃进行响应面优化试验。

2.2.3 时间对核桃青皮多酚提取效果的影响

由图2c可知，核桃青皮多酚提取量随着时间的延长而增加，当延长至75 min时提取量最大，继而随着时间的延长而减少。在一定时间范围内，延长提取时间可以增加多酚的溶出量，但当继续延长时，多酚已基本溶出或溶剂对物料的作用达到某种平衡，并且时间过长会破坏多酚的化学结构，影响多酚的提取效果[22-23]。综合考虑，选取60、75、90 min进行响应面优化试验。

2.2.4 液料比对核桃青皮多酚提取效果的影响

由图2d可知，核桃青皮多酚提取量随着液料比的增加呈先增加后降低的趋势，液料比为40 mL/g时反应体系达到平衡提取量最大。增加溶剂使核桃青皮粉颗粒的可扩散空间增加，使有效接触面积增加提高了传质推动力，同时使植物组织的浸润破裂效果更好，增加了多酚在溶剂中的溶解量；溶剂太少过于黏稠使物质间相互的作用力太小使多酚溶出率降低[24]。同时不当的液料比也会导致下游技术更复杂困难。综合考虑，选取30、40、50 mL/g进行响应面优化试验。

2.3 提取核桃青皮多酚响应面试验结果分析

2.3.1 响应面试验设计与结果

在单因素试验结果的基础上，确定尿素/氯化胆碱摩尔比为1.0，以温度（1）、时间（2）和液料比（3）3个因素为自变量，以多酚提取量为响应值（1），采用响应面法进行三因素三水平的试验设计，共包括17组试验方案。试验方案及试验结果见表2。

2.3.2 模型建立与方差分析

利用Design Expert 8.0.6软件对结果进行方差分析（见表3），对拟合回归方程进行方差分析和显著性检验，将数据进行多元回归拟合，得到多酚提取量（1）与温度（1）、时间（2）、液料比（3）的二次响应面回归方程为

回归方程一次项系数绝对值的大小，决定了各因素对响应值影响的主次顺序，所以各因素对多酚提取量的影响由大到小依次为123，即温度、时间、液料比，本试验所建模型中12312影响均极显著（<0.01），23132232影响均显著（<0.05）。

表2 响应面试验设计与结果

从表3可知，以多酚提取量为响应值时，模型=0.002<0.01，表明该二次方程模型极显著，失拟项不显著（>0.05），说明该模型成立。模型的决定系数2=0.997，说明该模型试验值与预测值高度拟合；校正决定系数2Adj=0.996，表明有99.64%的响应值变化可以用模型来解释，且2和2Adj均接近1，说明模型准确性和通用性较高；变异系数CV=1.90%＜10%，说明试验的可信度与精确度高，所以可以用此模型对核桃青皮多酚提取工艺进行分析和预测。

表3 回归方程的方差分析

注：“*”表示差异显著（<0.05）；“* *”表示差异极显著（<0.01）。

Note: “*” indicating significant difference (<0.05); “* *” indicating extremely significant difference (<0.01).

2.3.3 响应面图形分析与优化

利用Design Expert 8.0.6软件对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到的二次回归方程的响应面如图4所示。温度和时间交互作用的等高线几乎呈圆形，表明两者交互作用对核桃青皮多酚的提取效果无显著影响，从三维图可以看出，随温度和时间的增加多酚提取量呈先增大后减小的趋势；温度与液料比相互作用的等高线呈椭圆形，表明两者相互作用极显著，从三维图可以看出，随温度和液料比的增加多酚提取量呈先增加后减小的趋势；液料比与时间相互作用的等高线呈椭圆形更为明显，表明两者相互作用极为显著，这与方差分析结果基本一致。

通过 Design Expert 8.0.6 软件分析得到核桃青皮多酚的优化提取条件温度85 ℃，时间62 min，液料比50 mL/g，理论多酚提取量50.91 mg/g。采用理论优化提取条件，进行3次平行试验，验证结果的准确性，得到多酚提取量平均值为50.87 mg/g，与理论值相比，相对误差为2.03%，说明该模型可以较好地模拟和预测核桃青皮多酚提取量，从而证明提取参数的可行性。

2.4 核桃青皮多酚抑菌活性试验结果分析

DES-OC、DES-OC-青皮多酚对3种受试菌均具有一定抑菌作用（图5）。

根据抑菌圈判定依据[24]：菌圈直径大于15.0 mm为高度敏感，10.0～15.0 mm为中度敏感，7.0～9.0 mm为低度敏感，无抑菌圈者不敏感。由表4可知，DES-OC对和抑菌活性中度敏感、抑菌活性高度敏感。核桃青皮多酚有一定的抗菌性，当DES-OC中存在青皮多酚时，从表4可以看出，DES-OC-青皮多酚较单一的DES-OC对3种受试菌抑菌效果更好，即和抑菌活性提高到高度敏感，的抑菌活性则更加强烈（抑菌圈直径达到31.7±0.16 mm）。

表4 抑菌活性试验结果（抑菌圈直径）

注：“－”表示没有观察到抑菌圈，下同。

Note: “－”means that the inhibition zone is not observed. The same below.

表5为不同浓度的DES-OC-青皮多酚对抑菌活性效果。DES-OC-青皮多酚对在0.05～0.40 mg/mL浓度范围内均有抑菌圈的出现。在DES-OC-青皮多酚浓度高于0.35 mg/mL时高度敏感；在0.05～0.40 mg/mL浓度范围均有敏感性，在浓度高于0.35 mg/mL时高度敏感；在0.05～0.40 mg/mL浓度范围内处于低中度敏感。该试验结果充分说明DES-OC-青皮多酚对的抑菌效果最佳，次之，最后为。

表5 不同浓度DES-OC-青皮多酚的抑菌圈直径

3 结 论

1）本文采用低共熔溶剂（DESs）提取核桃青皮多酚，筛选确定草酸/氯化胆碱（DES-OC）提取多酚效果较好。

2）在单因素试验的基础上，确定草酸/氯化胆碱摩尔比1.0，采用响应面法得到优化工艺参数为温度85 ℃、提取时间62 min、液料比50 mL/g，理论多酚提取量50.91 mg/g。进行验证试验，实际多酚提取量50.87 mg/g，相对误差为2.03%，说明该模型可以较好模拟和预测DES-OC提取核桃青皮中多酚的效果，从而证明该提取条件的可行性。

3）通过抑菌试验研究，发现DES-OC与核桃青皮多酚混合溶剂对金黄色葡萄球菌（）大肠杆菌（）青霉菌（）均有一定的抑菌活性效果，对的抑菌效果最佳，次之，最后为，说明在天然保鲜剂开发和应用方面有较大的潜力。

DESs作为低成本、可食用、可选择组合的新型绿色溶剂，为提取农产品副产物中生物活性成分提供新思路，但DESs在提取过程中对活性成分的结构、理化性质的影响还需要进一步探索。

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Optimization of the technology for deep eutectic solvents extraction and antibacterial activity of walnut green husk polyphenols

Wang Tao, Liang Liang, Li Xurui, Hu Xuefang, Sun Junshe, Pei Haisheng※

(1.,100121,; 2.,,100121,)

In order to make full use of walnut by-products and reduce environmental pollution, walnut green husk was used as the research object. Polyphenols were extracted by different pH values (3,7,10) aqueous solution, 50% ethanol solution and Deep Eutectic Solvents (urea/choline chloride: DES-UC, oxalic acid/choline chloride: DES-OC). Firstly, under the conditions of temperature 80 ℃, liquid-solid ratio 25 mL/g, and molar ratio of Deep Eutectic Solvents (DESs) complexing agent 1.0, the extraction effect of DES-OC was better under 60 min. Subsequently, on the basis of single factor experiment, the response surface methodology was used to determine the optimal process parameters for the extraction of polyphenols from walnut green husk by DES-OC : the molar ratio of oxalic acid to choline chloride was 1.0, the temperature was 85 ℃, the time was 62 min, and the liquid-solid ratio was 50 mL/g. Under these conditions, the extraction amount of polyphenols was 50.87 mg/g. In addition, through the study on the antibacterial activity of the mixed solvent extracted from walnut green husk polyphenols, it was found that the antibacterial effect of DES-OC mixed with walnut green husk polyphenols onwas better, followed byand. The results can provide a theoretical basis for the research and development of natural antibacterial agents and preservatives, broaden the processing and utilization of walnut green husk, and also provide new ideas for the extraction of bioactive components from by-products of agricultural products.

extraction; optimization; deep eutectic solvents; walnut green husk; polyphenols; antibacterial activity

汪涛，梁亮，李旭锐，等. 低共熔溶剂提取核桃青皮多酚工艺优化及其抑菌活性[J]. 农业工程学报，2021，37(5)：317-323.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.05.037 http://www.tcsae.org

Wang Tao, Liang Liang, Li Xurui, et al. Optimization of the technology for deep eutectic solvents extraction and antibacterial activity of walnut green husk polyphenols[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(5): 317-323. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.05.037 http://www.tcsae.org

2020-08-31

2021-02-09

国家自然科学基金面上项目（21776142）。

汪涛，研究方向为应用生物技术。Email：wangtao17190191990@126.com。

裴海生，高级工程师，研究方向为生物质资源综合利用方面的研究。Email：peihaisheng2001@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.05.037

TS209

A

1002-6819(2021)-05-0317-07