低温厌氧发酵对奶牛养殖废水沉降特征的影响

朱瑞清，牛永艳，毛　婷，王治业，杨　涛，季　彬，刘美玲，穆永松，白慧慧

低温厌氧发酵对奶牛养殖废水沉降特征的影响

朱瑞清1，牛永艳1，毛婷1，王治业1※，杨涛1，季彬1，刘美玲2，穆永松3，白慧慧4

（1.甘肃省科学院生物研究所，甘肃省微生物资源开发利用重点实验室，兰州 730000；2. 中国科学院西北生态环境资源研究院，兰州 730000；3. 甘肃华瑞农业股份有限公司，张掖 734500；4. 兰州理工大学生命科学与工程学院，兰州 730000）

为了降低养殖废水处理成本，增加有机肥水在喷滴灌系统中的透过性能，该研究以不同低温（10~25 ℃）条件对奶牛养殖废水进行厌氧发酵处理，并与传统厌氧发酵进行比较分析研究。结果表明：低温（15 ℃）条件下驻留时间4 d进行厌氧发酵能够改变养殖废水的沉降特征，养殖废水出现分层沉降现象，上清液浊度为1.4，上清液沉降情况可以达到稳定状态，干物质含量在2.3 %左右，75m筛滤渣含量接近0 %，可以通过喷灌滴灌系统；处理后的上清液CODCr降低至（2627.8± 548.1）mg/L，总氮降低至（565.2± 79.5）mg/L，粪大肠菌群降至360个/L，无害化程度达到国标要求。16S全长rRNA高通量测序结果显示，与传统颗粒状厌氧污泥207个otu相比，低温厌氧污泥中检测到199个otu，其中96个属于共有菌株，低温厌氧污泥菌群主要由厚壁菌门（）19.2 %、拟杆菌门（）18.9%、21.2%、10.6%和变形菌门（）6.3%组成，种水平以为优势菌属；在颗粒状厌氧污泥中门水平以为特有菌门，种水平以为优势菌属。因此在寒冷地区低温（15 ℃）厌氧处理能够减少废水处理能耗，实现废水无害化、总养分循环、水肥一体化、水资源回收利用，为循环农业和可持续发展提供研究基础。

发酵；有机质；浊度；低温厌氧；奶牛养殖废水；有机液肥；循环农业

0 引 言

随着规模化养殖业迅猛发展，畜禽养殖废水的污染问题日益突出[1]。按照国家《畜禽养殖业污染物排放标准》（GB 18596－2001）中30 m3/100 头牛‧d的水量消耗标准计算，则一个中型奶牛养殖场（按5 000头计）每天产生废水量可达1 500 m3。而按照传统三段式废水处理方式，即沉淀-厌氧-好氧法[1]处理要求需要将废水加热到36 ℃，根据热能公式计算将1 500 m3水由7 ℃升温至36 ℃需耗4.7×104kW·h/d能量，能耗巨大，难以回收利用。

养殖废水亦为肥水，经济可循环的处理方法是将种植养殖业进行结合，将废水无害化成为有机肥水进行还田[2-3]，使得大体量的淡水资源和氮磷钾等养分资源得以再利用[2]。喷滴灌设施可以实现水肥一体化，节省人工，并可以通过作物的水肥需求规律及时按需供给[3]。肥料进入喷滴灌系统需满足能够通过150m筛的要求[4]，无机水溶性肥料通过水肥一体化系统进行灌溉技术已经趋于成熟[3]，但有机肥料水肥一体化尚未见报道。

如何对大体量的养殖废水进行低能耗的，可进入大型农业滴喷灌设施的处理是实现水肥一体化的基本应用研究。生物厌氧处理过程不需要氧源，运行费用低，能够灭活病原体[5]，适用于处理高浓度的有机废水[6]，并且在养殖废水的处理上已有很多工程实例[7-9]。本文对低温厌氧发酵过程进行研究观测低温厌氧过程对废水的沉降特征变化，通过高通量测定奶牛养殖废水的低温厌氧处理厌氧污泥微生物群分析，通过响应面方法优化废水处理工艺，实现养殖废水无害化肥水化处理。

1 材料与方法

1.1 试验地与材料

试验地位于张掖市民乐县甘肃华瑞农业股份有限公司的奶牛养殖场及沼气站（100°40′9.9″E，38°44′3.1″N），民乐县年平均气温为4.1 ℃，气候条件较为寒冷。该公司的奶牛养殖场在栏头数为5 000头，每天产生肥水约1 000 m3，试验用废水均来自甘肃华瑞农业股份有限公司奶牛养殖场废水，该奶牛养殖场采用水清粪工艺，废水主要由垫圈沙土、尿液、粪便和饲料残渣、圈舍冲洗水、挤奶厅冲洗水组成，其中冲洗水占绝大部分，经过前处理后进行厌氧发酵试验，经过初沉、固液分离等前期处理后，排放的养殖废水由CODCr浓度30 000～60 000 mg/L左右降低至（8 316.2±779.3）mg/L左右。

1.2 厌氧发酵设备及运行情况

厌氧发酵设备来自于甘肃华瑞农业股份有限公司的沼气站，该沼气站共有3个厌氧发酵罐，每个厌氧发酵罐容积1 600 m3，埋深0 m，均为UASB（Up-flow Anaerobic Sludge Bed/Blanket）反应器，3罐独立发酵，3罐从左至右分别为1号罐、2号罐、3号罐，见图1。罐内部下方的进料口处，罐体中间位置，上方的溢流出料口处皆配备有温度传感器。罐侧壁和顶部设有保温夹层，保温层设计标准见表1。3个厌氧发酵设备（UASB）内部均设有加热盘管，可以通过加热的方式对发酵液温度进行控制。

表1 厌氧发酵设备保温层设计表

1号罐长期延用36 ℃的发酵条件，其内部接种的厌氧活性污泥是购买的颗粒状污泥，并经过长期驯化能够长期稳定的保持黑色颗粒状，较一般厌氧污泥具有较高的厌氧发酵活性。2号罐和3号罐由于沼气站产甲烷气量不足，无法满足加热需求，发酵温度由环境温度决定，在8.5～18.3 ℃之间浮动。

1.3 试验分组

试验利用UASB厌氧发酵罐在不同温度下对该养殖场的前处理后的奶牛养殖废水进行连续进出料厌氧发酵处理，试验观测时间从2018年4月20日至2020年8月20日。试验分为3组处理，各组分别进行连续进出料方式发酵。

第1组为对照组采用1号罐，按照传统方法发酵温度对废水进行36 ℃厌氧处理，试验开始前接种有颗粒状厌氧污泥。

第2组采用沼气站2号厌氧发酵罐，未接种任何污泥，直接进行厌氧发酵处理，利用加热盘管对发酵液进行加热控温，使之保持在10、15、20、25 ℃的4个梯度的恒温条件下，进料方式为批次进料，当温度上升到要求温度后开始计时，进行12 d时间的厌氧处理，分别于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 d取样检测。所有处理组处理完毕后，静置12 h后观测料液的沉降特征，对于分层明显的废水，分别对上清液和下层液体固体混合层进行生物物理化学等检测分析。长期观测2号罐15 ℃恒温厌氧发酵条件下的CODCr和总氮变化情况。

第3组未接种任何污泥，采用3号厌氧发酵罐，直接进行厌氧发酵处理，延续3号罐长期自然温度下发酵状况，连续进出料驻留时间视罐内温度而定，将罐内温度控制在8.5 ℃以上，长期以来不加热条件下达到的最高温度为18.3 ℃。

1.4 检测方法

75m孔径筛滤渣干质量是以75m孔径筛对废水进行过滤，将滤渣80 ℃烘箱进行烘干至质量恒定后称质量除以滤前废水质量，以百分比表示。干物质含量（%）是将废水80 ℃烘箱进行烘干至质量恒定后称质量除以烘干前废水质量，以百分比表示。

废水的浊度按照GB 13200-1991用分光光度法测定，CODCr按照GB/T 11914-1989用重铬酸钾法测定；废水悬浮物含量用GB/T 11901-1989质量法测定；总磷按照GB/T 11893-1989钼氨酸分光光度法检测；废水中钾按照GB 11904-89 水质钾和钠的测定火焰原子吸收分光光度法，总氮按照HJ 636-2012碱性过硫酸钾消解紫外的分光光度法检测，粪大肠菌群数按GB/T 19524.1-2004测定；蛔虫卵死亡率按GB/T 19524.2-2004测定。

1.5 响应面优化

在15 ℃厌氧条件下以浊度（）为评价指标，分别选取pH值（）、进水CODCr（）、时间（）为考察因素，根据 Box-Behnken 进行试验设计优化最佳工艺条件，变量的编码和水平表见表2。

表2 变量的编码和水平表

1.6 分析方法

原核微生物群落组成采用16S全长 rRNA高通量测序，OTUs分类采用 Illumina Miseq 平台（Illumina, USA）测序分析。使用Design-Expert V8.0.6软件进行响应面试验设计并进行相关数据分析。

2 结果与分析

2.1 能耗分析

在相同的驻留时间（4 d）、相同日进水量（370 m3）、同时期下对2罐发酵情况进行观测，不同的厌氧污泥（颗粒状厌氧污泥和低温厌氧污泥）和不同的温度（以36和15 ℃为设定温度）处理废水均能产生沼气。1号罐实际达到的平均温度为34.4 ℃，从2019年6月18日至2019年7月12日期间平均产出沼气886.6 m3/d，其中产气全部通过沼气锅炉燃烧用于自身废水加热，在消耗完自身产气后平均耗电2 997.7 kW·h/d。2号罐实际达到温度平均为15 ℃，恒温条件下平均产出沼气21 m3/d，同样在消耗完自身产气后平均日耗电132.7 kW·h/d，比36 ℃平均节约电能2.865 kW·h/d（详见表3）。本试验低温厌氧条件下可以产出甲烷，王世伟等[10]的低温厌氧发酵具有相似报道。

表3 不同日期废水发酵性质及能耗比较

2.2 废水沉降特征变化

在10、15、20、25 ℃恒温条件下，2号罐不同驻留时间的废水进行静置，静置6 h后观测厌氧发酵处理后料液的沉降特征变化。试验结果显示在10～25 ℃的温度变化下，随着厌氧温度的增加，废水达到分层的时间越短，其中在25 ℃时，废水在2 d就出现显著的分层状况。分层后上清液与下层沉淀的体积比约为1∶1，上清液的浊度随着厌氧时间的增加先降低，到低谷后又随着时间的增加而略有上升。

测量各温度下处理完毕的具有明显的分层沉降特征的废水浊度，其中浊度为0.6～1.4的上清液在常温下静置20 d未观测到显著的絮凝、沉淀、浊度及色泽变化，视为成功处理的稳定状态；浊度>1.4的上清液随着静置时间的增加会进一步发生絮凝、沉淀及色泽变浅现象，视为不稳定的分层状态。随着浊度的增加不稳定性增加。以浊度为指标，厌氧发酵处理时间有最佳时长，在10、15、20和25 ℃的条件下最佳处理时长分别为11、5、4和2 d。但同时以节能和生产效率和处理完毕上清液的稳定性做考量以15 ℃4 d为佳，详见表4。

将不同温度组处理好的浊度为0.6~1.4的上清液取出，做理化性质和养分检测，结果如表5。与进料原液相比，用75m孔径筛过滤后的上清液中滤渣干重接近0，是变化最明显的理化性质。上清液干物质含量下降了87.8%，是变化比较明显的理化性质之一。上清液中的CODCr浓度为（2627.8±548.1）mg/L，相较于进料原液下降了68.4%。处理后的上清液N含量下降了44.3%，P2O5和K2O含量分别降低了13.7%和6.3%。计算上清液中总养分（N+P2O5+K2O）浓度为1.744 9 g/L。

表4 厌氧发酵处理后料液的沉降特征和浊度变化

注：“NA”指无分层现象，无上清液样。

Note: “NA” means no delamination occurred either no supernatant sample available.

表5 进料原液与上清液基本理化性质对比

对浊度为0.6～1.4的上清液的粪大肠菌群数和蛔虫卵死亡率进行检测，粪大肠菌群数和蛔虫卵死亡率均能达到《禽畜养殖业污染排放标准GB18596-2001》[11]无害化要求，可以直接还田。结果见表6。

2.3 奶牛养殖废水的低温厌氧处理效果

对2号罐连续进出料，料液驻留时间4 d，15 ℃低温厌氧处理过程进行20 d连续观测，观测时间自2020年7月1日至7月20日，该方法去除污染物的效果如图2。图2记录了低温厌氧发酵中去除废水中CODCr的效果，废水的进料CODCr浓度为（8 393.4±426.6）mg/L，出料上清液CODCr浓度为（2 531.7±410.6）mg/L，去除率为69.9%±4.0%。

表6 进料原液与上清液环境无害化指标

2.4 奶牛养殖废水的低温厌氧处理厌氧污泥微生物群分析

对长期以自然发酵温度（8.5～18.3 ℃）发酵的3号罐的厌氧污泥（Lowtemp）和长期以36 ℃为发酵温度发酵的1号罐的驯化的购买的颗粒状污泥（Granu）进行微生物群落分析。表7为Alpha多样性指数统计表，表中Granu组Chao1和Ace指数均高于Lowtemp组，说明1号罐的颗粒状污泥物种数量较高，Granu组的Shannon指数大于Lowtemp组，而Simpson指数小于Lowtemp组，说明1号罐的颗粒状污泥物种多样性较高。在低温厌氧污泥中检测到199个otu，在颗粒状厌氧污泥中检测到207个otu，其中96个otu属于共有菌株。在不同运行温度下，厌氧发酵池的微生物群落结构门水平表征如图3所示，低温厌氧污泥菌群主要由厚壁菌门（）19.2%、拟杆菌门（）18.9 %、21.2%、10.6 %和变形菌门（）6.3%等组成；颗粒状厌氧污泥菌群主要由11.4%、拟杆菌门（）8.5%、4.7%、16.3%和变形菌门（）4.1%等组成。2者在门水平主要差异表现在颗粒状厌氧污泥菌群含有，而低温厌氧污泥不含有，有报道[12]认为该菌门具有硫氧化、有机物降解功能并可能和嗜甲烷菌的氧化代谢甲烷产物有关。

表7 Alpha多样性指数统计表

注：Lowtemp为厌氧污泥组，Granu为颗粒状污泥组。

Note: Lowtemp is anaerobic sludge group, Granu is granular sludge group.

为了深入研究奶牛养殖废水厌氧处理工艺中的微生物群落组成，在属水平上进行了丰度分析。低温厌氧污泥中为优势菌属，有报道[13-14]称该菌在牛羊粪便厌氧发酵中参与酸化、产甲烷等代谢活动，并有随着厌氧发酵时间的增长（59 d）会逐渐变成发酵菌群优势菌群的趋势，本试验结果可能是由于长期低温厌氧处理而形成。颗粒状厌氧污泥中硫脲菌属（）为优势菌属，多个研究显示属以深海热泉口为生境[15-18]。这和本文试验中长期保持36 ℃温度环境较为吻合，并有研究显示[19]此属菌以三羧酸循环方式固定碳源，以硫氧化过程获得能量，以硝酸盐为电子受体，因此可能在高浓度有机废水处理中具有重要意义。

低温污泥对废水沉降效果较好，提示低温污泥中含有分解和合成代谢活性的菌群，可能是由于96个共有otu中菌株的功能所致，其中高丰度菌为_sp和。有报道[20]称属的一株菌可以与一种甲烷螺菌属的菌株互养，参与丙酸盐代谢。另有报道[21]属菌株通过延胡索酸途径参与降解石蜡产甲烷代谢。报道较少。本研究观测到低温发酵产气量显著减少，提示在颗粒厌氧污泥特有的111个otu中可能含有高产甲烷的菌株，其中高丰度的菌株有sp、sp、和。其中被[22]报道称分离自热泉口，分泌胞外多糖，最适温度47～50℃。被报道称[23]属于嗜温菌、严格厌氧，最适温度30～37 ℃，分离自UASB颗粒状厌氧污泥，与本文吻合。

2.5 pH值、进水CODCr浓度、时间对处理好上清液浊度的响应面分析

利用Design-Expert软件中Box-Behnken 模型进行响应面优化试验，中心复合设计处理选项及结果见表8，浊度的回归模型及方差分析如表9，浊度的响应面见图4。浊度（）对pH值（）、进水CODCr（）、时间（）的二次多向回归方程为：=0.70−0.15−0.11+0.19− 0.25−0.15+0.075+0.312+0.842+0.592。模型F值为25.10，值<0.01，表明响应面回归模型达到了极显著水平；失拟项值＞0.05，失拟项不显著，说明模型与试验数据之间拟合度好；模型的确定系数2=0.969 9，说明该回归模型能解释96.99%响应值的变化，以分析和预测此模型对浊度的影响。由回归模型和方差分析可知，方程一次项、，方程二次项、2、2、2对浊度的影响达到极显著水平。根据值大小可以判断出各因素对浊度的影响的主次顺序为：时间、pH值、进水CODCr。

表8 中心复合设计处理选项及结果

表9 浊度的回归模型和方差分析

注：“*”表示差异显著（＜0.05）；“**”表示差异极显著（＜0.01）。

Note: “*” indicates a significant difference (<0.05), “**" indicates an extreme significant difference (<0.01).

根据Design-Expert 软件对建立的回归方程进行参数优化分析，可以得出在pH值、进水CODCr、时间理论上分别取6.54、19 265 mg/L、5.48 d时，可得理论上的最小浊度为0.68。结合实际操作条件修正pH值为6.5、进水CODCr为19 200 mg/L、时间为5 d进行验证试验，实测浊度为0.70。实测值与回归方程所预测值相差不大，说明响应面优化的研究合理。

3 结 论

厌氧处理是一种常见的生物处理方法，研究低温条件下厌氧发酵对中国广大寒冷地区养殖业废水处理具有现实意义。本文针对低温下废水有机成分的沉降特征，处理效果以及厌氧污泥微生物群落特征进行研究，得出以下结论：

1）能耗与环境温度、废水CODCr等多种因素相关，水的比热高，大体量的36 ℃废水含有的巨大内能，排放是造成能耗损失的主要原因之一。本文证明低温（15 ℃）厌氧和常温36 ℃厌氧均能产生甲烷和改进废水的沉降特性，在本试验条件及运行工况下36 ℃发酵所产生的甲烷不足以使料温上升到36 ℃，需要进一步耗费能源，15 ℃厌氧能耗比36 ℃情况下平均节约电能2 865 kW·h/d，若以肥料化为目的则低温发酵更为节能和经济。

2）低温条件下厌氧发酵对养殖废水的沉降特征具有显著的影响，10 ℃驻留9 d的条件下养殖废水出现沉降分层现象，上清液浊度在5左右。试验证明在常年平均气温为4.1 ℃的地区，没有外源加热的情况下，奶牛养殖废水的厌氧发酵处理对废水的沉降、分层效果仍有一定作用。最节能并高效的低温厌氧处理条件为15 ℃驻留时间4 d。

3）低温条件下厌氧发酵的上清液可以通过75m孔径筛，滤渣含量接近0%，干物质含量在2.3%左右，粪大肠菌群数为360个/L，蛔虫卵死亡率>95%，可规模化处理养殖废水并可通过喷灌滴灌系统进行施肥、浇水，实现化肥减量化、有机肥料水肥一体化、淡水资源再利用。

4）低温自然形成的厌氧污泥和长期以36 ℃发酵条件驯化的购买的颗粒状污泥均具有产甲烷活性和对废水进行沉降的功能，但处理效率和活性具有显著不同。微生物群落在门水平主要差别为门，在属水平存在较大差异，可能受污泥环境温度影响较大。

5）响应面分析结果显示15 ℃厌氧情况下，各因素对浊度的影响的主次顺序为：时间、pH值、进水CODCr。

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Influence of low-temperature anaerobic fermentation on sedimentation characteristics of dairy wastewater

Zhu Ruiqing1, Niu Yongyan1, Mao Ting1, Wang Zhiye1※, Yang Tao1, Ji Bin1, Liu Meiling2, Mu Yongsong3, Bai Huihui4

(1.,,,730000,; 2.,,730000,; 3..,.,734500,; 4.,,730000,)

Large volume of dairy wastewater has caused a great threat to the ecological environment, due to the difficulty to treat it. Traditional treatment requires more heating energy at the least temperature of 36℃. Alternatively, non-hazardous fertilizers are widely expected to treat wastewater, particularly easy soluble in water to transfer through dripping or spraying irrigation. However, the chemical fertilizers derived from wastewater contain many organic matters and nutrients, resulting in the blockage of spray nozzles. In this study, a feasible bio-treatment of dairy wastewater was proposed using the low-temperature anaerobic fermentation, thereby lowering energy consumption, while increasing the fluid permeability through dripping or spraying irrigation. The treated dairy wastewater was observed in the anaerobic fermentation at low temperatures (10-25 ℃) through an array of time points by no inoculants, as well as at a normal temperature of 36 ℃ by inoculants of granular anaerobic sludges. A full-length 16S rRNA gene sequencing was used to detect microbiological compositions. Response surface analysis was performed on fermentation parameters. The results showed that there was a significant influence of anaerobic fermentation under low temperature on the sediment characteristics of dairy wastewater. The sedimentation and layering performance of wastewater were significant under the condition of 9 days at 10 ℃, where the turbidity of supernatant was about 5. The most energy-efficient and economical condition was at 15 ℃ in the 4 d for the low-temperature anaerobic treatment. There was an average energy saving of 2 865 kW·h/d by l5 ℃ anaerobic fermentation with ambient temperature around 7.8 ℃, compared with fermentation at 36 ℃. Low-temperature anaerobic fermentation changed the sedimentation characteristics of wastewater over a longer time but with equal quality, where supernatant CODCrwas reduced to (2 627.8±548.1) mg/L, nitrogen to (565.2±79.5) mg/L, fecal coliforms to around 360 g/L, the residue ratio of the dry filter by mesh diameter 75m filters approximately to 0 %. The dry matter ratio of supernatant dropped from 18.9% to 2.3% after treatment, while a part of of wastewater was recycled as irrigation water, where the total nutrients (N+P2O5+K2O) content of supernatants were 1.744 9 g/L. The number of fecal coliforms reduced down to 360 g/L, while, the mortality ratio of ascarid egg was above 95%. Both granular and low-temperature sludges showed the treating functions of wastewater (methanogenesis and wastewater turbidity change), but with different efficiency, where 199 otu were detected in the anaerobic sludges via the full-length 16S rRNA gene sequencing, while 207 otu in the acclimatized granular anaerobic sludges, and 96 otu were common in both sludges.was a dominant species in the long-term (over 6 mon) low-temperature conditioned anaerobic sludges, while genus Sulfurovum dominated in inoculated granular anaerobic sludges. In the study site with the mean annual temperature of 4.1 ℃, low-temperature (15 ℃) anaerobic fermentation saved much more energy consumption than the thermal anaerobic fermentation (36 ℃). The supernatant could transmit through to the nuzzle irrigation, the environmental non-hazardous proxies met with the discharge requirements of the national standard. The finding can provide a potential application for future recycling in agriculture and sustainable development.

fermentation; organic substance; turbidity; low-temperature anaerobic fermentation; dairy wastewater; organic liquid fertilizer; circular agriculture

朱瑞清，牛永艳，毛婷，等. 低温厌氧发酵对奶牛养殖废水沉降特征的影响[J]. 农业工程学报，2021，37(5)：224-230.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.05.026 http://www.tcsae.org

Zhu Ruiqing, Niu Yongyan, Mao Ting, et al. Influence of low-temperature anaerobic fermentation on sedimentation characteristics of dairy wastewater[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(5): 224-230. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.05.026 http://www.tcsae.org

2020-11-23

2021-02-10

甘肃省科学院应用研发项目（2018JK-04）；甘肃省科学院产业化项目（2019CY-04）；甘肃省自然科学基金（20JR10RA027）

朱瑞清，博士，副研究员，研究方向为环境微生物相关。 Email：153380101@qq.com

王治业，研究员，研究方向为微生物资源开发。 Email：zhiye_wang@sina.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.05.026

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1002-6819(2021)-05-0224-07