芦荟凝胶多糖对急性放射性皮肤损伤模型的修复作用及机制研究

2021-05-12 12:47刘太阳刘卓卓
局解手术学杂志 2021年5期
关键词:芦荟放射性低剂量

刘太阳,刘卓卓,朱 玉,李 博

(1.重庆市涪陵中心医院烧伤整形科,重庆 408000;2.重庆市涪陵区妇幼保健院妇科,重庆 408000)

放射治疗简称放疗,是临床上治疗恶性肿瘤的常用手段,放射线在杀死肿瘤细胞的过程中也会损伤患者周围正常组织、器官,其中放射性皮肤损伤是放射治疗的主要并发症[1]。目前主要通过外敷乳膏、喷剂等治疗放射性皮肤损伤,例如细胞因子类、三乙醇胺乳膏以及糖皮质激素软膏等药物,也有少数通过静脉注射放射防护药物,但治疗效果均不显著[2-3]。芦荟凝胶多糖是芦荟中重要的生物活性物质,研究显示,其生理活性较强,在免疫调节方面具有广谱性,同时在抗辐射、抗肿瘤方面效果显著,还具有抗溃疡、美容护肤等功效[4-5]。目前芦荟凝胶多糖对急性放射性皮肤损伤的研究较少。本研究通过探讨芦荟凝胶多糖对急性放射性皮肤损伤模型的修复作用及相关机制,以期为其临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

选取40只雄性Wistar大鼠,体质量为160~220 g,均由华阜康生物科技股份有限公司提供[动物生产许可证号为SCXK:(京)2019-0017]。所有大鼠均单笼饲养,自由饮水、进食,室温18~25 ℃。库拉索芦荟购自海南南洋芦荟生物工程有限公司,酶联免疫试剂盒及其分析纯购自美国GIBCO公司,苏木精—伊红试剂购自上海慧颖生物科技有限公司,VEGF抗体及PI3K、Akt、mTOR一抗和二抗购自武汉艾德思科技文化有限公司,BCA试剂盒及其试剂购自上海晶抗生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 急性放射性皮肤损伤模型建立 40只大鼠中选取10只为正常组,其余30只参考文献[6]建立急性放射性皮肤损伤模型:将大鼠固定后,采用脱毛试剂(饱和硫化钠+等量滑石粉)在大鼠左后肢均匀涂抹,20 min后用纱布去除试剂并进行脱毛处理;0.1%戊巴比妥钠腹腔麻醉,大鼠在摆位床中呈环形,保证左后肢在射线照射范围内;使用铅板对非照射部位进行遮挡。采用6 MeV电子线照射大鼠左后肢脱毛部位的皮肤,剂量率为400 cGy/min,一次性照射剂量为40 Gy。正常组仅做脱毛处理。

1.2.2 芦荟凝胶多糖制备及分组 摘取新鲜芦荟叶,清洗干净后,经过剪刺、去皮,将凝胶打浆,取100 g采用超声波协同复合酶法[7]浸提,真空抽滤,减压浓缩至20 mL,加4倍体积无水乙醇沉淀,于4 ℃静置过夜。经过沉淀、过滤后,分别添加无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,最后冷冻、干燥,得到白色粉末。采用硫酸—蒽酮法测定多糖含量,其范围在5~40 μg/mL。30只模型大鼠随机分为低剂量组、高剂量组、模型组各10只。低剂量组、高剂量组分别以单层纱布浸润0.4 mg/mL、0.8 mg/mL的芦荟凝胶多糖外敷干预;模型组和正常组的单层纱布浸润的等体积生理盐水外敷,各组大鼠均连续干预1个月。

1.2.3 创面愈合时间、放射性皮肤损伤评级 记录各组大鼠创面愈合时间。参考急性放射性皮肤损伤评级标准[8]对模型大鼠皮肤损伤状况进行评估:0级,大鼠皮肤无任何变化;Ⅰ级,大鼠皮肤表现为点状红斑,脱毛,呈干性脱皮;Ⅱ级,大鼠皮肤红斑明显,伴有斑状湿性脱皮,中度水肿;Ⅲ级,大鼠产生融合性湿性脱皮,凹陷水肿;Ⅳ级,大鼠皮肤出现溃疡、出血、坏死等。

1.2.4 创面微血管密度、VEGF含量检测 抽取大鼠腹部静脉血3 mL,以3 000 r/min离心10 min,分离上层血清。采用酶联免疫法检测VEGF含量:将提前稀释好的标准品100 μL加入相应的微孔板反应孔中,第1孔只加样品稀释液为零孔。盖上模板混合均匀,在37 ℃下反应90 min,甩去孔内液体,吸干水分;将准备好的0.1 mL VEGF抗体加入到每孔中,在37 ℃下反应60 min,空白孔不加底物四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMS);甩去孔内液体,每孔加满0.01 mol/L PBS,浸泡1~2 min,甩去孔内液体,吸干水分;每孔加入90 μL TMS,避光处理15~20 min;每孔加入90 μL TMS终止液,即蓝色变为黄色。在波长450 mm处分析VEGF水平。制作常规石蜡切片,选择10个连续不重叠的切片于高倍镜下观察微血管数量。

1.2.5 病理学观察 处死大鼠,解剖后快速提取左后肢皮肤组织制作标本,4%多聚甲醛固定,制作常规石蜡切片;0.5%苏木精—伊红染色10 min,自来水冲洗1次;乙醇梯度脱水,中性树胶封片,显微镜下观察染色结果。

1.2.6 PI3K-Akt-mTOR信号通路相关蛋白表达检测 采用Western blot检测,将采集到的血液标本以3 000 r/min离心处理10 min,取上清液,采用BCA法进行蛋白定量测定,在2×SDS凝胶缓冲液中加入蛋白50 μg,于100 ℃下加热5 min进行蛋白变性。凝胶电泳,转膜,取膜,于4 ℃在5%脱脂牛奶中固定、封闭处理1 h,使用0.05%~0.1% TBST稀释一抗(PI3K、Akt、mTOR,1∶1 000),于4 ℃孵育过夜保存,之后使用0.05%~0.1% TBST洗膜3次,每次5 min。0.05%~0.1% TBST稀释二抗(1∶10 000),摇动孵育1 h,再次用TBST连续洗膜3次,每次5 min。DAB显色,定量分析蛋白表达情况。以GAPDH为内参。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 创面愈合时间比较

低剂量组和高剂量组创面愈合时间均短于模型组,且高剂量组短于低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

*:与模型组比较,P<0.05;#:与低剂量组比较,P<0.05

2.2 放射性皮肤损伤评级比较

与模型组相比,正常组大鼠0级较多,Ⅳ级较少;与模型组比较,低剂量组和高剂量组大鼠Ⅳ级较少,差异有极显著性统计学意义(P<0.01),见表1。

表1 放射性皮肤损伤评级比较(n=10,只)

2.3 创面微血管密度、VEGF含量比较

模型组、低剂量组和高剂量组创面微血管密度、VEGF含量均低于正常组(P<0.01);低剂量组和高剂量组创面微血管密度、VEGF含量高于模型组(P<0.01);高剂量组创面微血管密度、VEGF含量高于低剂量组,差异有极显著性统计学意义(P<0.01),见图2。

2.4 病理学观察

在显微镜下观察发现,正常组表皮细胞较为平整,棘细胞、成纤维细胞排列整齐,未发现狭窄、增宽等,皮脂腺、毛囊、汗腺等正常,肌纤维结构正常,无炎症细胞浸润;模型组细胞表皮呈波浪状,不整齐,无棘细胞排列,胶原纤维、毛囊、汗腺被破坏,真皮层内有大量炎症细胞浸润,新生血管较为少见;低剂量组和高剂量组溃疡表面有新生皮肤、肉芽形成,新生血管明显增加,炎症细胞浸润程度降低,其中高剂量组皮脂腺、毛囊、汗腺结构正常,胶原纤维、纤维母细胞数量增加,排列整齐(图3)。

a:创面微血管密度;b:VEGF含量 *:与正常组比较,P<0.01;#:与模型组比较,P<0.01;△:与低剂量组比较,P<0.01

2.5 PI3K-Akt-mTOR信号通路相关蛋白表达

模型组、低剂量组和高剂量组PI3K、Akt蛋白表达量均低于正常组,mTOR蛋白表达量高于正常组(P<0.05);低剂量组和高剂量组PI3K、Akt蛋白表达量高于模型组,mTOR蛋白表达量低于模型组(P<0.05);高剂量组PI3K、Akt蛋白表达量高于低剂量组,mTOR蛋白表达量低于低剂量组(P<0.05),见图4。

3 讨论

临床上将放射性皮肤损伤分为慢性放射性皮肤损伤、急性放射性皮肤损伤以及放射性皮肤癌[9]。放射性皮肤损伤患者临床表现主要为局部皮肤瘙痒,严重者会发生脱皮、疼痛、溃疡等,造成局部感染;病情严重的患者皮肤会变薄,产生瘢痕、挛缩[10-11]。研究证实,放射性皮肤损伤会降低患者生存质量,进而大大降低患者对放射治疗的依从性[9],导致患者中断放疗,甚至是放弃治疗,致使肿瘤得不到控制,生存率降低[12]。Yee等[13]的研究指出,在不降低放射治疗效果的情况下,尽量减少放射治疗对患者周围正常皮肤组织产生的伤害,能明显减轻患者痛苦,提高患者生活质量,增加放射治疗的依从性。

*:与正常组比较,P<0.05;#:与模型组比较,P<0.05;△:与低剂量组比较,P<0.05

临床研究显示,芦荟具有免疫调节、抗炎、抗病毒、抗真菌感染、抗辐射、促进伤口愈合等多种功效,在治疗烧伤、创伤方面效果显著[14]。芦荟的化学成分相对复杂,有160多种成分,主要是以糖类、醌类化合物为主,还包括大量的有机酸、氨基酸等,维生素、酶类物质也相对丰富,其中芦荟多糖是芦荟凝胶中最主要的活性物质[15-16]。目前,芦荟多糖在烫伤、烧伤方面的研究较多,但是其在放射性皮肤损伤中的应用相对较少。目前,放射性皮肤损伤发病机制尚未明确,有学者认为放射线会导致机体中p53和Bax蛋白表达升高,使局部组织中的血管内皮细胞、成纤维细胞以及表皮细胞发生坏死和凋亡,新生血管减少,创面收缩,进而导致表皮化发生[17]。也有研究指出,放射线会破坏活性氧、自由基结构及机体上皮细胞基底层,导致放射性皮肤损伤发生[18]。

本研究中,大鼠创面经过不同浓度的芦荟凝胶多糖干预后,创面愈合时间有不同程度的缩短,其中高剂量组创面愈合时间最短,说明芦荟凝胶多糖能促进放射性皮肤损伤创面愈合,且更高剂量的芦荟凝胶多糖对促进愈合的效果更好。放射性皮肤损伤大鼠皮肤损伤评级越高,皮肤损伤越严重[19]。本研究中,模型组大鼠皮肤损伤评级Ⅳ级的数量较多,主要表现为表皮厚度增加,脱皮、水肿、溃疡严重。低剂量组和高剂量组大鼠皮肤损伤为Ⅳ级的数量较模型组少,说明低剂量和高剂量芦荟凝胶多糖均能改善放射性皮肤损伤大鼠皮肤损伤状况。

创面微血管发生栓塞会导致组织缺血缺氧,这也是创面坏死的主要原因,创面微血管数量与组织中血流、氧供的修复有关,若创面有丰富的新生血管形成,创面组织能够获得足够的营养物质以及氧,则可加快创面愈合速度[20-21]。VEGF是内皮细胞中重要的趋化因子,主要通过角质、巨噬细胞分泌合成,VEGF会增加内皮细胞纤溶酶原激活剂、胶原酶含量,促进毛细血管融合,形成大血管,在血管内皮细胞的迁移、增殖过程中发挥着重要作用,可促进新生血管形成[22-23]。本研究结果显示,大鼠创面经不同浓度芦荟凝胶多糖干预后,创面微血管密度、VEGF含量均有不同程度的提高,其中高剂量组效果最为显著,说明芦荟凝胶多糖能促进VEGF合成和释放,促进放射性皮肤损伤模型创面新生血管形成,进一步加快大鼠创面愈合,且具有剂量依赖性。

PI3K是一种磷脂酰肌醇激酶,主要存在于细胞中,其活性主要体现在丝氨酸/苏氨酸激酶方面,通过激活下游信号分子,在多种细胞活动中发挥着重要的作用[24]。Akt在磷酸化作用下,会激活mTOR,参与生物学活动[25]。PI3K/Akt信号通路在细胞凋亡过程中具有重要作用[26]。在创面早期,自噬是细胞保护机制之一,mTOR参与信号转录以及蛋白合成过程,并且mTOR在自噬信号转换中发挥着关键性的作用,可诱导细胞自噬[27-28]。本研究结果表明,经不同浓度芦荟凝胶多糖干预后,大鼠PI3K、Akt蛋白表达量升高,mTOR蛋白表达量降低,说明芦荟凝胶多糖可能通过调控PI3K-Akt-mTOR信号通路相关蛋白,促进大鼠创面愈合。在创面早期,由于炎症反应导致创面缺血、缺氧,营养不足,mTOR通路将细胞中的坏死物质清除,有助于保持细胞结构的稳定,抵抗病原体入侵,减轻炎症反应,加快创面愈合速度[29-30]。

综上所述,高剂量芦荟凝胶多糖能促进急性放射性皮肤损伤大鼠模型创面新生血管形成,加快创面修复,其作用机制可能与PI3K-Akt-mTOR信号通路有关。

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