60种中草药对舒伯特气单胞菌的体外抑菌作用

周 梦， 余 米， 张承露， 封孝兰， 郑永华

(1.重庆市药物种植研究所， 重庆 南川 408435； 2.西南大学 动物科技学院， 重庆 北碚 400715)

0 引言

【研究意义】杂交鳢(Channamaculata♀×C.argus♂)是由乌鳢(Channaargus)与斑鳢(Channamaculata)人工杂交而成的子一代，因其具有良好的杂种优势，且具有肉质细腻、味道鲜美、刺少和出肉率高等特点，深受国内外消费者的喜爱。杂交鳢还具有补脾利水、去瘀生新等药用价值，可作为创伤、手术后滋补调养的食疗材料，使得杂交鳢成为我国重要的淡水养殖品种[1-3]。但随着养殖户开始采用大规模、高密度的人工养殖模式，导致各种疾病频发，其中由舒伯特气单胞菌感染引起的内脏类结节病是鳢科鱼类常见疾病之一。舒伯特气单胞菌为气单胞菌科(Aeromonadaceae)气单胞菌属(Aeromanas)，为革兰氏阴性杆菌。该菌广泛存在于淡水、海水、土壤、鱼类和脊椎动物中，既可引起人类皮肤和软组织感染、坏死性筋膜炎败血症等，亦可引起养殖鱼类的内脏类结节病，是一种人畜鱼共患条件性致病菌[4-5]。当前对鱼源舒伯特气单胞菌的防治主要采用抗生素抑杀病原菌，由此造成的环境污染及细菌耐药性问题对水产养殖业乃至整个生态环境都存在巨大隐患。中草药作为在水产养殖中常用的药物，不仅具有资源丰富、毒副作用小、不易产生耐药性等优势，还具有抗菌、增强免疫等作用。选择防治效果好的中药材应用于舒伯特气单胞菌的防治具有重要意义。【前人研究进展】当前对水产养殖中舒伯特气单胞菌的研究主要集中在病原菌的分离鉴定及快速检测方法[6-7]等方面。【研究切入点】利用中草药防治鱼类细菌性疾病[8-11]备受关注，但目前针对中草药体外抑制舒伯特气单胞菌作用的报道相对较少。【拟解决的关键问题】选取60 种中草药，研究其对杂交鳢源舒伯特气单胞菌的体外抑菌作用，以期为防治杂交鳢源舒伯特气单胞菌诱发的疾病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中草药 试验选用60种中草药作为研究对象，试验中草药及其供试部位详见表1，所用中草药均购自重庆北碚万和大药房。

表1 60种中草药名录

续表1

1.1.2 受试菌种 菌株：舒伯特气单胞菌(Aeromonasschubertii)菌株WL-1，由中国水产科学研究所珠江水产研究所分离鉴定和保存提供。

1.1.3 试剂 试验用琼脂粉、氯化钠、氢氧化钠、无水乙醇，购自成都市科龙化工试剂厂；牛肉膏和蛋白胨，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母浸膏，购自北京双旋微生物培养基制品厂。

1.2 方法

1.2.1 中草药提取液的制备 试验中草药提取液制备采用煎煮方法。将购置的中草药置于恒温箱65(±5) ℃下干燥5 h；用粉碎机将干燥后的中草药进行粉碎，然后每种中草药取10 g放入洁净烧杯中，按1∶10加水浸泡30 min，再放置电炉上煎煮30 min。用纱布将煎煮完的药液过滤，重复此过程3 次，分别得到3 次药液。将所得药液合并，蒸馏浓缩至药液内含原药1 g/mL。最后用高压灭菌锅(121℃，20 min)灭菌后，置于冰箱4℃保存备用。

1.2.2 菌悬液的制备 试验菌培养：将菌株活化，用接种针在固体培养基上划线，再28℃培养24 h后，挑取单个菌落，接种到营养肉汤培养基上震荡培养24 h。采用平板计数法将菌液稀释到合适浓度，菌液浓度为1×108CFU/mL。

1.2.3 抑菌圈的测定 采用琼脂扩散法[12]，先使用无菌棉签蘸取浓度约为1×107CFU/mL的菌液轻轻的均匀涂抹在平板培养基上，再用打孔器(直径为6.00 mm)在平板上均匀打孔，每个平板上打4 个孔，挑出孔内琼脂并用火焰封底，做好标记。每孔加入100 μL(1 g/mL)药液，然后将之放入28℃培养箱中培养24 h；平板取出后，观察孔周围是否有抑菌圈，若有，则用游标卡尺测量抑菌圈直径。每种药物3次重复，同时以无菌水做空白对照。结果判断按《中药药理学》[13]介绍的标准：抑菌圈≥20 mm，属于极敏；抑菌圈15 ～ 19 mm为高敏；抑菌圈10 ～ 14 mm属于中敏；抑菌圈小于10 mm，属于低敏；没有抑菌圈，属于不敏(无抑菌效果)。

1.2.4 最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度的测定 用营养肉汤培养基以二倍稀释法[14]对提取物进行梯度稀释，取灭菌有硅胶塞的试管10 支，编号，每管先加入无菌肉汤培养基 2.0 mL，然后于第1 管中加入灭菌的受试药液2.0 mL，混匀后取出2.0 mL放入第2 管中，依次稀释成8 个2 倍系列浓度，第9 管不加药液，作阳性对照，最后加入细菌悬液，使细菌浓度达106CFU/mL，第10 管加受试药液2.0 mL，混匀后取出2.0 mL弃去，不加细菌，作为阴性对照。于28℃，200 r/min摇床中震荡培养24 h，然后取出与对照管对比观察，无混浊现象所对应的药物浓度为该中草药对舒伯特气单胞菌的最小抑菌浓度，每个浓度重复3 次。在MIC试验基础上，摇动混匀试管中菌液后于28℃下继续培养24 h，观察结果，清澈透明无浑浊现象的试管即为无菌生长试管，无菌生长试管中的最低药物浓度，即为最小杀菌浓度。

1.3 数据处理

采用Excel 2003和SPSS 13.0对数据进行处理，结果均用平均值±标准差(X±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 中草药的抑菌效果

从表2可知，60 种中草药提取液对舒伯特气单胞菌的抑菌效果各不相同。在1 g/mL浓度下，60种中草药中五倍子、大黄、黄柏、黄连、地榆、丁香、木瓜、诃子、五味子、儿茶、乌梅的抑菌效果最显著，其抑菌圈直径均大于20 mm， 为极敏药物；其中威灵仙、千里光、虎杖、石榴皮、黄芩、毛冬青、连翘和厚朴8 种中草药的抑菌效果次之，其抑菌圈直径在15 ～ 20 mm，属于高敏药物；鱼腥草、薄荷、赤芍、白芍、筋骨草、夏枯草、紫花地丁、槟榔、甘草9 种中草药抑菌效果较差，抑菌圈直径在10 ～ 15 mm，属于中敏药物；仙鹤草、马兜铃、茵陈蒿3 种中草药抑菌效果不明显，抑菌圈直径小于10 mm，属于低敏药物；剩余大青叶等29 种中草药无抑菌效果。因此，初步筛选出五倍子、大黄、黄柏、黄连、地榆、丁香、木瓜、诃子、五味子、儿茶、乌梅11 种抑菌效果较好的中草药。

表2 60种中草药提取液对舒伯特气单胞菌的抑菌圈直径及抑菌等级

续表2

2.2 最小抑菌及杀菌浓度

从表3可知，五倍子的抑菌杀菌效果最好，其MIC和MBC均为1.95 mg/mL；其次为诃子、乌梅、地榆、黄连、儿茶和丁香，其MIC和MBC分别为1.95 mg/mL和3.91 mg/mL、3.91 mg/mL和3.91 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL；再次，木瓜、五味子的MIC和MBC均为15.63 mg/mL和15.63 mg/mL；大黄和黄柏的MIC和MBC分别为31.25 mg/mL和31.25 mg/mL、62.50 mg/mL和62.50 mg/mL，抑菌效果较差。

表3 11种中草药提取液对舒伯特气单胞菌的最小抑菌及杀菌浓度

3 讨论

舒伯特气单胞菌是一种新型的人、兽、鱼共患致病菌，对我国水产养殖业的发展造成严重威胁，而现有的药物防控效果不理想。为有效防控该病，试验以患病杂交鳢体内分离的舒伯特气单胞菌为供试菌，采用琼脂扩散法对60 种中草药进行抑菌中草药筛选。结果表明，五倍子、大黄、黄柏、黄连、地榆、丁香、木瓜、诃子、五味子、儿茶、乌梅11 种中草药抑菌效果较好。采用二倍稀释法测定筛选出的抑菌作用较好的中草药水提物对杂交鳢源舒伯特气单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度结果表明，五倍子抑菌效果最好，对舒伯特气单胞菌的MIC和MBC均为1.95 mg/mL，诃子、乌梅、黄连、地榆、丁香、儿茶、木瓜、五味子、大黄、黄柏的MIC和MBC分别为1.95 mg/mL和3.91 mg/mL、3.91 mg/mL和3.91 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL、7.81 mg/mL和7.81 mg/mL、15.63 mg/mL和15.63 mg/mL、15.63 mg/mL和15.63 mg/mL、31.25 mg/mL和31.25 mg/mL、62.5 mg/mL和62.5 mg/mL。研究结果既为开发潜在的防治舒伯特气单胞菌的药物提供了科学依据，也为进一步筛选出具有高效、低副作用的中草药复方奠定了基础，在健康养殖中具有较好的应用前景。

试验从60 种中草药中筛选出31 种具有抑菌效果的中草药，其中乌梅等28 种中草药对供试菌株的敏感度达中敏以上。这些中草药在现代药理研究中已证实都有明显的抗菌作用[9-15]。但其抑菌强弱有所不同，五倍子等11 种中草药水提物的抑菌效果较好，其抑菌圈直径均达20 mm以上。这主要是由于每种中草药有效成分的种类、含量以及抑菌机制存在差异，导致抑菌效果有所不同。其中，乌梅的抑菌效果最强，抑菌圈直径达28.62 mm。乌梅含有的成分复杂多样，如乌梅醇、有机酸等，有可能在乌梅抑菌和杀菌过程中起到了主要作用，也可能是多个水平的共同作用，从而达到抑菌的目的。夏与晴等[16]研究发现，乌梅抑制嗜水气单胞菌的抑菌圈直径为12.38 mm。李蕴玉等[17]研究显示，乌梅对鸡致病性绿脓杆菌分离株H2的抑菌圈直径为24.5 mm。说明同一种中草药对不同致病菌的抑菌效果也有一定差异，原因可能是起作用的有效成分不同，亦或是抑菌机制不同造成的。

试验结果表明，五倍子的MIC和MBC均为1.95 mg/mL，抑菌、杀菌效果最好。该结果与琼脂扩散法测定的抑菌圈结果不一致。这可能是由于各中草药水提物在平板上的扩散能力不同，乌梅水提物在平板上扩散能力较强，且在其扩散范围内能抑制细菌的生长，所以形成的抑菌圈较大。虽然五倍子水提物对舒伯特气单胞菌的抑菌效果可能强于乌梅水提物，但其在平板上的扩散能力低于乌梅水提物，导致其抑菌圈也较小。因此，需要结合多种方法加以评价某种中草药的体外抑菌效果，而不能仅以单一方法进行评价。

有研究发现，中草药的抑菌、杀菌效果与其含有的抗菌有效成分密切相关，中草药的有效活性成分主要包括生物碱类、醌类、有机酸类、黄酮类、鞣质类、活性多糖类等[18-27]。但中草药活性成分在体外和体内的作用环境下相差甚大，而研究仅在体外进行中草药抑菌效果评估，因此还需结合动物体内试验进一步评价，以期开发为渔药。

4 结论

抑菌杀菌效果最好的是五倍子，其最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度均为1.95 mg/mL，其次是诃子、乌梅、地榆、黄连、儿茶和丁香，再次是木瓜和五味子；大黄和黄柏较差。