黑牛肝菌多糖超声提取工艺优化及抗氧化研究

景年华 史俊友 田照秀 成琴

摘要：以云南大理黑牛肝菌为材料，使用超声辅助萃取及水提醇沉法提取多糖，采用单因素试验及正交试验对黑牛肝菌多糖提取工艺进行优化，并对黑牛肝菌多糖进行了提取;对所得多糖进行DPPH自由基、ABTS自由基清除能力及铁氰化钾还原能力试验，对其抗氧化活性进行比较研究。结果表明，黑牛肝菌多糖最佳提取工艺为料液比1∶25（g∶mL）、醇沉浓度80%、超声时间70min、超声功率90%，在此条件下多糖含量为79.41mg/g。醇沉浓度为80%时，多糖提取物抗氧化活性最强，多糖对DPPH、ABTS自由基清除率及总还原力吸光度分别为97.92%、99.80%和0.789;醇沉浓度为50%时，所得多糖对DPPH、ABTS自由基清除率及总还原力吸光度分别为85.79%、88.23%和0.713，抗氧化活性最低;表明黑牛肝菌多糖对自由基有较好的清除效果及还原作用。

关键词：黑牛肝菌;多糖;超声波辅助萃取;工艺优化;抗氧化活性

中图分类号R284.2文献标识码A

文章编号0517-6611（2021）08-0170-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.08.045

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

StudyonOptimizationofUltrasonicExtractionProcessandAntioxidantofPolysaccharidesfromBoletusaereus

JINGNian-hua，SHIJun-you，TIANZhao-xiuetal（QujingNormalUniversity，Qujing，Yunnan655011）

AbstractWithDaliBoletusaereusasthematerial，thepolysaccharidewasextractedbyultrasonic-assistedextractionandwaterextractionandalcoholprecipitation.SinglefactortestandorthogonaltestwereusedtooptimizetheextractionprocessofBoletusaereuspolysaccharides，andthepolysaccharidesofBoletusaereuswereextracted.Additionally，acomparativestudyonscavengingabilitiesofDPPH，ABTSandreducingpowerofpotassiumferricyanidefortheobtainedpolysaccharideswascarriedout.TheresultsshowedthatthebestextractiontechnologyofpolysaccharidesfromBoletusaereuswasthesolid-liquidratio1∶25（g∶mL），ethanolconcentrationof80%，ultrasonictimeof70minandultrasonicpowerof90%.ContentofpolysaccharideobtainedfromBoletusaereuswas79.41mg/gunderthebestextractionconditions.Antioxidantactivityofpolysaccharideprecipitatedby80%ethanolwasthestrongest，scavengingratesofDPPH，ABTSandabsorbanceoftotalreducingpowerwere97.92%，99.80%and0.789respectively.Antioxidantactivityofpolysaccharideprecipitatedby50%ethanolwasthelowest，scavengingratesofDPPH，ABTSandabsorbanceoftotalreducingpowerwere85.79%，88.23%and0.713，respectively.TheseresultsshowedthatpolysaccharidesfromBoletusaereushadgoodscavengingabilityandreducingpower.

KeywordsBoletusaereus;Polysaccharides;Ultrasonicassistedextraction;Processoptimization;Antioxidantactivity

牛肝菌是菌物界中比较大型的担子菌重要代表[1]，属担子菌亚门担子菌纲牛肝菌目牛肝菌科牛肝菌属，下有11～20属。中国牛肝菌科有400多种，其中有毒不可食用的牛肝菌约30多种，大多数无毒无苦辣无刺激味的种类均可食用[2]。牛肝菌是一种山区特有的野生菌类，主要生长于混交林中[3]，一般单生或群生，云南省是牛肝菌的主要分布地区，目前已知牛肝菌244种，其中可食用牛肝菌144种[4]，医学上认为牛肝菌食药同源，食药兼有，是一种能同时药用和食用的野生菌资源，含有丰富的营养价值，因此具有较好的开发和利用价值[5]。黑牛肝菌又名铜色牛肝菌，是一种低脂肪、低热量、高蛋白的食药两用野生真菌，相关报道较少[6]。

多糖是天然大分子物质，在动物细胞膜、微生物细胞壁及高等植物中均有分布[7]。大量研究数据表明，多糖在生物体中具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤、致突变以及免疫调节等功能[8]。真菌多糖具有多种药理活性，对人体有显著的保健功效。自由基具有强氧化活性，长期存在于机体中会对免疫能力有所损坏，而多糖在自由基清除中扮演着较为重要的角色，对自由基有良好的清除效果。牛肝菌多糖作为牛肝菌多种药理活性的主要物质基础，主要含有木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖等，对自由基清除效果明显，具有很强的抗氧化活性。现代药理学研究表明，牛肝菌多糖具有多种生物活性及功能，如调节免疫活性、降血脂、抗突变、抗感染、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化等[9-10]。因此，研究牛肝菌多糖无论在食品领域还是医药领域均具有一定的現实意义，目前对于牛肝菌多糖的提取多集中于传统热水法[5，11-13]，但该法存在能耗大、耗时长、提取率低等缺点。基于此，该试验以云南大理黑牛肝菌为主要原料，使用超声波辅助萃取和水提醇沉法提取多糖，采用单因素试验和正交试验对黑牛肝菌多糖提取工艺进行优化，并对黑牛肝菌多糖进行提取;同时对所得多糖进行DPPH自由基、ABTS自由基清除能力及铁氰化钾还原能力试验，对其抗氧化活性进行比较研究。

1材料与方法

1.1材料与试剂黑牛肝菌产自云南大理州，试验备用。DPPH（分析纯，上海如吉生物科技发展有限公司）、ABTS（分析纯，合肥博美生物科技有限责任公司）及其他试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备小型高速粉碎机（WK-600A），青州市精诚医药装备制造有限公司;紫外-可见分光光度计（TU1810PC），北京普析通用仪器有限责任公司;旋转蒸发仪（RE-52AA），上海亚荣生化仪器厂;电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9101-3），金坛市杰瑞尔电器有限公司;循环水式真空泵（SHZ-（Ⅲ）），上海標和仪器有限公司;超声波清洗器（SK3200LHC），上海科导超声仪器有限公司;电子分析天平（CP214），上海奥豪斯仪器有限公司;数显恒温水浴锅（XMTD-204），上海双捷实验设备有限公司;台式低速离心机（80-2），上海医疗器械（集团）有限公司;优普系列超纯水仪（UPH-IV-20T），成都超纯科技有限公司。

1.3试验方法

1.3.1超声辅助提取黑牛肝菌多糖。黑牛肝菌子实体烘干粉碎，精确称取5.0000g已粉碎牛肝菌，加入一定量蒸馏水，超声波辅助提取一定时间，提取结束后，4000r/min离心15min，取上清液抽滤，得样品提取液。

1.3.2黑牛肝菌多糖含量测定。

1.3.2.1葡萄糖标准曲线的绘制。精密移取0.1mg/mL葡萄糖标准溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60mL于具塞比色管里，移取适量蒸馏水补足体积至2mL，摇匀，继续加入1mL6%苯酚溶液后，向具塞比色管中迅速加入5mL浓硫酸，充分振荡摇匀后，室温下放置显色20min，以零号管作为空白对照，于490nm波长处测定其吸光度。以葡萄糖含量（mg）为横坐标、对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.2.2多糖含量测定。黑牛肝菌多糖含量测定采用苯酚-硫酸法[14-15]，试验步骤与“1.3.2.1”葡萄糖标准曲线的绘制一致，测定样品吸光度，将此数值带入标准曲线，计算黑牛肝菌多糖含量（mg/g）。

1.3.3单因素试验。准确称取牛肝菌粉末5.0000g，以水为提取溶液进行单因素试验。选取料液比、超声提取时间、超声功率及醇沉浓度4个影响牛肝菌多糖提取的因素，以牛肝菌多糖含量为指标，进行单因素试验。料液比为1∶5、1∶15、1∶25、1∶35、1∶45（g∶mL）;超声时间为30、40、50、60、70min;超声功率为60%、70%、80%、90%、100%;醇（乙醇）沉浓度为50%、60%、70%、80%、90%。

1.3.4正交试验。根据单因素试验结果选择合适的料液比（A）、超声时间（B）、超声功率（C）和醇沉浓度（D）为参考因素，以多糖含量为考察指标，采用L9（43）正交表（表1），进行正交试验，对超声提取牛肝菌多糖工艺进行优化，以确定最佳提取工艺条件。

1.3.5黑牛肝菌多糖抗氧化活性试验。

1.3.5.1黑牛肝菌多糖提取。依据正交试验所得最佳提取工艺条件提取黑牛肝菌多糖，烘干至恒重。

1.3.5.2DPPH自由基清除能力测定。参照许效群等[16-17]试验方法，并稍作修改。准确移取2.00mL不同浓度多糖溶液于具塞比色管中，向比色管中依次加入2.00mL0.06mg/LDPPH溶液，置于暗处反应30min，于517nm处测定其吸光度，平行测定3次，计算清除率。

1.3.5.3ABTS自由基清除能力测定。取7mmol/LABTS溶液5.00mL，加入88μL140mmol/L过硫酸钾，室温下置于暗处反应12～16h。用甲醇稀释该溶液，于734nm处测定其吸光度，约为0.7，得ABTS自由基溶液。参照李帆等[18-19]试验方法进行试验，对试验步骤稍作修改，准确移取0.50mL不同浓度多糖溶液于具塞比色管中，向比色管中依次加入4.50mLABTS自由基溶液，于37℃水浴10min后，于734nm处测定其吸光度，平行测定3次，计算其清除率。

1.3.5.4还原力测定。参照吴海涛等[20]的铁氰化钾还原法并稍作修改，准确吸取1.00mL不同浓度多糖溶液于具塞比色管中，依次加入0.1mol/L磷酸缓冲液（pH=7.4）及质量分数为1%铁氰化钾溶液各2.00mL，充分混匀，于50℃水浴20min后，向比色管中加入2.00mL10%三氯乙酸溶液，振荡混合后，静置15min。取上清液2.00mL，依次加入2.00mL水和1.00mL0.1%三氯化铁溶液，混匀，静置10min后反应溶液由黄色变为蓝色，于700nm处测定吸光度，空白对照以蒸馏水代替样品，平行测定3次。

2结果与分析

2.1葡萄糖标准曲线的绘制以吸光度为纵坐标、葡萄糖含量（mg）为横坐标绘制标准曲线（图1），得出线性回归方程为y=8.007x-0.006（R2=0.9990），试验结果表明葡萄糖含量为0.02～0.14mg时，标准曲线呈现良好的线性关系。

2.2单因素试验

2.2.1料液比对黑牛肝菌多糖提取的影响。从图2可以看出，料液比为1∶5～1∶25时，随着提取溶剂体积的增加，多糖含量逐渐升高，这是因为蒸馏水用量增加，使得多糖充分溶解，提取含量升高，而料液比为1∶25～1∶45时，随着提取溶剂的增加，多糖含量稍微下降，这可能是因为随着蒸馏水的增加，黑牛肝菌中其他的亲水性物质也大量溶解，使得多糖溶解量降低[21]。由此可知，黑牛肝菌多糖提取时，试验最佳料液比为1∶25，此时黑牛肝菌多糖提取效果较好。

2.2.2超声时间对黑牛肝菌多糖提取的影响。从图3可以看出，超声时间为30～60min时，随着超声时间逐渐延长，多糖含量逐渐升高，这是因为超声时间越长，黑牛肝菌细胞破碎越为彻底，多糖溶出量增加，提取含量升高;而超声时间为70min时，随着超声时间的延长，多糖含量稍微下降，这可能是因为时间过长，细胞进一步破碎导致杂质的溶出相应增多，使得多糖的溶出量降低，另外超声有较强的机械振动剪切作用，长时间会使大分子多糖断裂，降低黑牛肝菌多糖的提取率[21]。由此可知，黑牛肝菌多糖提取时，试验最佳超声时间为60min，此时黑牛肝菌多糖提取效果较好。

2.2.3超声功率对黑牛肝菌多糖提取的影响。从图4可以看出，超声功率为60%～100%时，随着超声功率的增大，多糖含量逐渐升高，这可能是因为超声时间固定，超声波的破碎作用主要取决于超声功率，超声功率越大，对细胞的破碎作用越强，多糖溶出量增加，提取含量升高。而超声功率为80%～100%时，随着超声功率逐渐增大，多糖含量增幅不大，这可能是因为超声功率过大时，提取液的流动加速，减少了黑牛肝菌在超声场中的停留时间而导致细胞破碎减弱，从而导致多糖含量增幅不大。因此，黑牛肝菌多糖提取时，试驗最佳超声功率为80%，此时黑牛肝菌多糖提取效果较好。

2.2.4醇沉浓度对黑牛肝菌多糖提取的影响。从图5可以看出，醇沉浓度为50%～90%时，随着醇沉浓度的增大，多糖含量逐渐升高，这是因为80%、90%乙醇的极性更接近于多糖的极性，增加了牛肝菌多糖的溶解从而提高多糖提取量;而醇沉浓度为90%时，相比较醇沉浓度为80%时，多糖含量无显著上升趋势，这可能是因为随着醇沉浓度的增加，含水量相对减少所导致的结果。因此，黑牛肝菌多糖提取时，试验最佳醇沉浓度为80%，此时黑牛肝菌多糖提取效果较好。

2.3正交试验根据单因素试验结果选择合适的料液比（A）、超声时间（B）、超声功率（C）、醇沉浓度（D）为参考因素，以多糖含量为考察指标，采用L9（43）进行正交试验，对超声提取牛肝菌多糖工艺进行优化，其试验结果见表2。由表2可知，各因素对黑牛肝菌多糖提取含量的影响程度从大到小依次为A、D、C、B，即料液比的影响程度最大，其次是醇沉浓度和超声功率，超声时间的影响程度最小;以黑牛肝菌多糖含量为考察指标的最佳提取条件为A1B3C3D2，即料液比1∶25、超声时间70min、超声功率90%、醇沉浓度80%;在此条件下，提取黑牛肝菌多糖以进行验证性试验，所得多糖含量为79.41mg/g（n=3），此数值均大于正交试验各试验结果，结果表明该提取工艺稳定可行。

2.4黑牛肝菌多糖抗氧化活性研究

2.4.1不同醇沉浓度黑牛肝菌多糖对DPPH自由基清除能力比较。从图6可以看出，多糖浓度为0.5～3.5g/L时，不同醇沉浓度所得多糖溶液对DPPH自由基清除效果随浓度增大，清除率明显上升。当多糖浓度为3.5～5.5g/L时，多糖溶液对DPPH自由基清除效果逐渐趋于平缓，此时醇沉浓度为80%时，所得多糖对DPPH自由基清除效果最好，清除率可达97.92%;醇沉浓度为50%时，DPPH自由基清除效果较弱，清除率为85.79%。多糖浓度为0.5～2.0g/L时，醇沉浓度为90%时，多糖对DPPH自由基清除效果较其他醇沉浓度多糖效果明显。不同醇沉浓度所得多糖对DPPH自由基清除效果随浓度的增加而增强，后续趋于平缓。醇沉浓度为50%时，所得多糖清除率为21.24%～85.79%;醇沉浓度为60%时，所得多糖清除率为27.71%～96.49%;醇沉浓度为70%时，所得多糖清除率为27.48%～96.77%;醇沉浓度为80%时，所得多糖清除率为34.99%～97.92%;醇沉浓度为90%时，所得多糖清除率为38.56%～90.64%。当多糖质量浓度均为5.5g/L时，醇沉浓度为60%、70%和80%时，黑牛肝菌多糖对DPPH自由基清除效果接近，清除率分别是96.47%、96.77%、97.92%。试验结果显示黑牛肝菌多糖对DPPH自由基有较强的清除能力。

2.4.2不同醇沉浓度黑牛肝菌多糖对ABTS自由基清除能力比较。从图7可以看出，多糖浓度为0.5～4.0g/L时，不同醇沉浓度所得多糖溶液对ABTS自由基的清除效果明显上升;多糖浓度为4.0～5.5g/L时，多糖溶液对ABTS自由基清除效果逐渐趋于平缓。醇沉浓度为50%时，黑牛肝菌多糖溶液清除率为29.87%～88.23%;醇沉浓度为60%时，多糖溶液清除率为29.42%～96.99%;醇沉浓度为70%时，多糖溶液清除率为31.77%～95.54%;醇沉浓度为80%时，多糖溶液清除率为37.91%～99.80%;醇沉浓度为90%时，多糖溶液清除率为35.80%～98.34%。不同醇沉溶度所得黑牛肝菌多糖溶液对ABTS自由基清除效果为80%>90%>60%>70%>50%。试验结果显示牛肝菌多糖对ABTS自由基有较强的清除能力。

2.4.3不同醇沉浓度黑牛肝菌多糖还原力比较。从图8可以看出，多糖浓度为2～10g/L时，不同醇沉浓度所得多糖溶液对铁氰化钾的还原能力明显增强，多糖浓度为10～12g/L时，不同醇沉浓度所得多糖溶液对铁氰化钾的还原能力趋于平缓。多糖浓度为12g/L时，80%醇沉浓度所得多糖对铁氰化钾的还原能力最强，吸光度为0.789，醇沉浓度50%所得多糖对铁氰化钾的还原能力较弱，吸光度为0.713。不同醇沉浓度所得多糖溶液对铁氰化钾的还原能力均随质量浓度的增大而增强，然后趋于平缓。由图8可知不同醇沉浓度所得多糖对铁氰化钾的还原能力不同，80%醇沉浓度所得多糖最强，其次为60%醇沉浓度所得多糖。试验结果显示牛肝菌多糖对铁氰化钾具有较强的还原能力。

3结论

该试验以黑牛肝菌为原料，采用超声波辅助提取，通过单因素及正交试验得黑牛肝菌多糖提取工艺条件，其最佳提取工艺条件为料液比1∶25、超声时间70min、超声功率90%、醇沉浓度为80%，在该提取工艺条件下，对黑牛肝菌多糖进行提取，得多糖含量为79.41mg/g。以料液比1∶25、超声时间70min、超声功率90%对黑牛肝菌多糖进行提取，选用不同醇沉浓度对糖提取液进行沉淀，对所得多糖的抗氧化活性进行了比较研究。根据结果综合来看，当醇沉浓度为80%时，多糖提取物抗氧化活性最强，多糖对DPPH、ABTS自由基清除率及总还原力吸光度分别可达97.92%、99.80%和0.789;醇沉浓度为50%时，所得多糖对DPPH、ABTS自由基清除率及总还原力吸光度分别为85.79%、88.23%和0.713，抗氧化活性最低。结果表明黑牛肝菌多糖对自由基有较好的清除能力及还原作用。

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