犊牛热射病诱发荚膜A 型多杀性巴氏杆菌感染的诊断

张建东，车国喜，程子龙，刘思当，刘蒙达

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271000；2.山东省医疗器械产品质量检验中心，山东济南 250000；3.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

热射病是在高温、高湿环境下引起的中枢神经系统、血液循环系统机能紊乱以及呼吸障碍，表现为呼吸急促、体温升高、脉搏加速、精神沉郁、口吐白沫等症状，后期表现为兴奋不安、狂躁、全身出汗、呼吸困难、张口喘气、卧地不起、四肢划动，与日射病统称为中暑[1-3]。热射病多发生在炎热的夏秋季节，是因高温、高湿或烈日照射引起全身代谢紊乱以及血液循环和中枢神经系统高度障碍的急性病，一旦发生，往往病情急剧，严重者可迅速死亡[4]。该病在我国南方很常见，近几年在北方夏季也比较普遍，若饲养管理不当或者发现不及时，就会导致严重的经济损失[5-6]。

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，以下简称巴氏杆菌）是一种引起动物呼吸系统感染或败血症的重要病原，包括3 个亚种，即多杀亚种（P.multocidassp.multicida）、败血亚种（P.multocidassp.septica）及杀禽亚种（P.multocidassp.gallicida）[7]，常引起牛的败血症、肺炎及胃肠炎；有5 个荚膜血清型，分别为A、B、D、E 和F 型，其中A 型和B 型毒力较强，致死率也较高。每种荚膜血清型都可引起不同动物发病[8]。牛肺脏中常存在巴氏杆菌，当机体抵抗力下降时，病菌会突破免疫防线，侵入机体并大量繁殖，发生继发感染。从全世界范围来看，巴氏杆菌也是引起牛呼吸系统疾病的主要病原，给我国乃至世界养牛业造成了较大经济损失[9]。

2019 年7 月，山东省某规模化肉牛场在8 d内累积出现22 头犊牛死亡。对牛场调查发现，发病牛群缺乏必要的降温措施，体温普遍较高，有明显的呼吸困难、咳嗽、气喘、精神沉郁等症状，部分牛瞳孔扩大；对病死牛剖检发现，肺脏呈暗红色，肿大，肺脏表面附有纤维素性渗出物，以及心内外膜、胆囊浆膜出血等。为确诊病因，采集病变器官组织进行病理组织学检查、细菌分离鉴定以及分离菌的动物致病性试验。

1 材料与方法

1.1 样品采集

从发病牛场无菌采集病死牛的心脏、肝脏、肺脏、肾脏等器官组织，将采集的病料分为两份：一份用10%的福尔马林溶液固定，用于病理组织学检查；另一份放入冷藏保温箱，带回实验室用于后续的细菌分离鉴。

1.2 主要试剂

胰蛋白胨大豆琼脂固体培养基（TSA）、胰蛋白胨大豆琼脂液体培养基（TSB）、脑心浸液琼脂培养基，参照兽医微生物学试验指导，按照常规方法配制；引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；rTaq酶、DL 2 000 DNA Marker、dNTP，均购自TaKaRa 公司；ddH2O，由本实验室制备；细菌DNA 提取试剂盒，购自杭州博日生物科技有限公司；胶回收试剂盒、革兰氏染色液、瑞氏染色液、胎牛血清、福尔马林溶液、硫酸、氯化钡、试管、培养基，均购于泰安美兴生物科技有限公司。

1.3 实验动物

体质量18～22 g 的SPF Balb/C 小鼠，购于泰安市泰邦技术有限公司。

1.4 体温测量

对牛场部分犊牛，在早、中、晚3 个时间段进行体温动态测量，观察并记录体温变化。

1.5 病理组织学检查

将采集的病料置于4%的中性缓冲福尔马林溶液中固定，然后进行切片制作，HE 染色。在光学显微镜下进行病理组织观察。

1.6 细菌分离培养

取低温保存的肺脏组织，接种于TSA 固体培养基，置于37 ℃恒温培养箱培养24 h，观察细菌生长情况和菌落形态。挑取单个菌落划线接种于脑心浸液琼脂平板（含有5 胎牛血清），观察细菌生长情况、菌落形态。挑取单个菌落置于载玻片上，用50 μL 无菌PBS 涂匀，进行革兰染色，镜检观察染色特性及形态特征。

1.7 细菌鉴定

利用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取分离菌的基因组DNA，用巴氏杆菌特异性引物进行PCR扩增，然后将PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的基因片段进行测序。

1.8 分离菌株荚膜血清型鉴定

以分离菌株基因组DNA 为模板，分别用5 对鉴别引物（表1）进行PCR 扩增。产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的基因片段并进行测序。

表1 引物设计及扩增[10]

1.9 分离菌致病性试验

吸取50 μL 摇匀的菌液，用TSB 液体培养基作20 倍稀释，然后将0.2 mL 稀释菌液放入无菌平皿内，再加入适量已熔化的45 ℃的营养琼脂培养基，混匀并冷却，待凝固后，置37 ℃恒温培养箱培养24 h，待菌落长出后计数（CFU/mL）。计算公式：每毫升原菌液活菌数=同一稀释度3 个重复平皿菌落平均数×稀释倍数×5。将20 只Balb/C 小鼠随机分成4 个组，每组5 只；将100、10、1 CFU的菌液，分别接种第1～3 组，每只腹腔注射0.2 mL；第4 组腹腔注射无菌TBS 0.2 mL/只作为对照。攻毒后，连续15 d 观察并记录Balb/C 小鼠的发病状态和死亡情况；解剖死亡小鼠，观察器官病理变化，并进行细菌分离鉴定。

2 结果

2.1 体温监测

随机选定19 头犊牛连续3 d 进行早、中、晚直肠体温测量，经过连续3 d 体温测量，发现中午犊牛体温普遍较高，并且高于正常体温（图1）。

2.2 病死牛剖检病变

病死牛呈败血症病变：肝脏呈暗红色，肿大（图2-A）；心外膜点状出血（图2-B）；肾脏呈暗红色，肿大，表面有坏死灶（图2-C）；肺脏呈暗红色肝样硬变（图2-D），小叶间有胶冻样水肿（图2-E），表面附有纤维素性渗出物（图2-F）。

2.3 病理组织学病变

主要的病理组织学病变：肺脏小叶间隙及肺泡内充满淡红色浆液（图3-A、3-B）；肾小管上皮细胞变性、坏死，间质出血（图3-C、3-D）；心肌纤维变性、坏死，间质出血（图3-E）；肝细胞变性、肿大，并有大量嗜中性粒细胞浸润（图3-F）。

2.4 细菌分离培养

用肺脏、肝脏、脾脏和肾脏组织分别进行细菌分离培养，在TSA 平板上培养24 h 后，发现有灰白色、圆形隆起半透明、光滑湿润、边缘整齐的水滴样菌落，无溶血现象；经革兰氏染色，可见两端钝圆、两极着色的阴性短杆菌。

图1 随机抽取犊牛连续3 d 的体温测量结果

图2 病死犊牛剖检病变

图3 组织病理学病变检查结果

2.5 细菌分离鉴定及分型

以菌株DNA 为模板，用巴氏杆菌特异性引物扩增出目的片段（图4-A）。通过与GenBank 中巴氏杆菌特异性基因比对，发现核苷酸同源性为99.5%。以菌株DNA 为模板，分别用荚膜血清A、B、D、E、F 型引物进行基因扩增，发现只有荚膜血清A 型引物扩增出目的条带（图4-B），说明分离菌株为牛巴氏杆菌A 型。

2.6 致病性试验

试验结果显示：100 CFU 组小鼠在1 d 内全部死亡，10 CFU 组6 d 内死亡3 只，1 CFU 组10 d内死亡1 只，而对照全部存活，说明分离到巴氏杆菌A 型有较强致病性。剖检死亡小鼠可见，肺脏出血，胸膜与心脏粘连，肝脏和肾脏表面有出血点，并且从肺脏中分离到巴氏杆菌。

3 讨论

图4 巴氏杆菌分离鉴定及分型结果

热射病对成年动物影响较小，但对于幼年动物影响较大。犊牛身体发育不成熟，适应环境能力差，更易发生热射病并继发细菌感染。夏季是高温季节，应采取降温措施。此牛场养殖环境本身就存在问题，驻场兽医未了解该病的发生原因，未采取相应的处理措施，这反映出我国规模化养殖环境下兽医临床诊断能力的不足，无法准确找到病因并及时采取相应的防制措施。此牛场通风不良，因而在牛舍高温、高湿环境下易发生热射病。通过及时改善舍内环境，降低牛群饲养密度，并添加防治细菌感染及抗应激药物，犊牛体温逐渐恢复正常，死亡得以控制。夏季一定要做好牛群的防暑降温工作。热射病会导致奶牛食欲降低、采食量下降，从而导致营养物质摄入不足，奶牛泌乳量下降，同时出现体质下降，免疫机能降低，继而引发其他疾病，严重时导致死亡。随着养牛产业化发展，国外在营养供给、饲养管理、防病治病、抗应激和动物福利等方面做得较好，而国内还处于从散养到规模化养殖的过渡阶段，牛场饲养管理水平跟国外相比还有一定差距[11]，部分牛场夏季降温工作做得不好。通过搭设凉棚、安装空调、喷洒冷水、通风、提高牛舍隔热性能和饮冷水等物理方法，可使环境温度控制在适宜范围之内，从而化解热应激反应带来的危害[12]。

巴氏杆菌是条件性致病菌，存在于正常牛体内，与宿主共生。当遇到天气变化、营养不良、感染病毒性疾病等因素，导致机体免疫力下降时，巴氏杆菌会大量增殖，导致感染性疾病发生[13]。国内近年来有大量关于巴氏杆菌A 型感染的报道。马文戈等[14]在东北地区部分牛场发现由荚膜A 型巴氏杆菌引起的犊牛死亡。本实验室在2018 年发现犊牛感染巴氏杆菌A 型，主要死于以纤维性肺炎为特征的败血症[15]。2017 年于力等[16]调查发现了巴氏杆菌A 型引起的纤维素性化脓性肺炎。2018 年林立山等[17]对鼻拭子进行细菌分离，结果分离到的31 株巴氏杆菌全是A 型。2019 年吴同垒等[18]调查巴氏杆菌在肉牛养殖中的流行率，结果分离到的25 株细菌全是巴氏杆菌A 型。

巴氏杆菌的传染源是病牛和带菌牛，通过排泄物不断污染环境，健康牛既通过消化道传染，也可以通过呼吸道传播。该病全年任何季节都能够发生，尤其在阴湿寒冷、早晚温差较大时更容易发病，往往呈地方性流行或者散发[19]。本病例确诊为热射病继发感染A 型巴氏杆菌。到牛场考察发现，牛场四周围墙和降温条件简陋。犊牛热射病继发巴氏杆菌感染的主要临床症状为肺炎型，犊牛早中晚体温差别明显，未发现浮肿型与败血型病例。热射病继发巴氏杆菌感染的肺脏病变明显，在肺脏中分离容易分离到细菌（在其他脏器中分离较困难），然后通过组织病原学检测、生化鉴定试验、细菌染色镜检等可以确诊。夏季牛场犊牛呼吸道疾病频发，因此应注意牛场温度变化，及时对牛群进行降温，以免造成损失。为预防此类病例发生，建议早期对未断奶犊牛接种疫苗，用适宜药物预防，如对犊牛注射恩诺沙星，同时加强牛场管理尤其是犊牛舍卫生消毒，可有效预防此类疾病，从而降低经济损失。疫苗接种与药物预防是主要措施，对犊牛进行疫苗注射，在不良环境下，增添药物，可以减少经济损失。我国疫苗株一直使用巴氏杆菌B 型，其对A 型免疫保护力较低，因此建议加快血清A 型巴氏杆菌疫苗的研发。

综上所述，夏季应加强奶牛场犊牛的饲养管理，改善其养殖环境，注意防暑降温，增强牛的体质，防止继发细菌感染，以避免不必要的经济损失。