雪山草鸡感染传染性法氏囊病病毒新型变异株的鉴定

姜 楠，王雨龙，张文英，牛鑫鑫，刘长军，高玉龙，高 立，崔红玉，李 凯，潘 青，张艳萍，刘爱晶，王笑梅，3，祁小乐

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150069；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，世界动物卫生组织传染性法氏囊病参考实验室，黑龙江哈尔滨 150069；3.扬州大学，江苏省动物重要疫病与人畜共患病协同创新中心，江苏扬州 225009）

传染性法氏囊病（infectious bursal disease，IBD）是由传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）引起雏鸡的一种急性、高度接触性、免疫抑制性传染病[1]。IBDV 主要侵害雏鸡的中枢免疫器官法氏囊，导致其不同程度损伤，进而引起免疫抑制，造成疫苗免疫失败，严重威胁养禽业的健康发展。

IBDV 的基因组为分节段的双链RNA，分为A、B 两个节段，A 节段长3 260 bp，包含两个部分重叠的开放阅读框架（open reading frame，ORF）。小ORF 在前，编码VP5 蛋白；大ORF 在后，编码NH2-pVP2-VP4-VP3-COOH 多聚蛋白。多聚蛋白被具有水解酶活性的VP4 蛋白水解为pVP2、VP4 和VP3，之后pVP2 被进一步加工形成成熟的VP2[2]。VP2 蛋白是IBDV 的衣壳蛋白和主要保护性抗原，其编码基因是IBDV 最重要的毒力基因，也决定着IBDV 的细胞嗜性。VP2 蛋白高变区（第206～350 位氨基酸）易发生突变，是A 节段基因特征的代表区段，常被用于IBDV 的遗传演化分析[3]。B 节段长2 827 bp，仅编码具有RNA 依赖的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）活性的VP1 蛋白。VP1 蛋白与IBDV 毒力和遗传演化也有重要关系[4-5]。VP1蛋白第110～252 位氨基酸序列被称为B-marker，是B 节段基因特征的代表区段[6]。

1957 年，IBDV 首次在美国特拉华州甘布罗镇被发现，随后演化出了经典毒株（classic IBDV，cIBDV）、变异毒株（variant IBDV，varIBDV）和 超 强 毒 株（very virulent IBDV，vvIBDV）。vvIBDV 和varIBDV 于20 世纪80 年代末和90 年代初在我国相继出现，且vvIBDV 的高致死率给养禽业造成了巨大经济损失[7]。随着饲养环境的改善和疫苗的广泛应用，vvIBDV 的流行正在被有效控制。然而近年来，IBDV 新型变异株在我国主要养禽地区广泛流行，在肉鸡群[8]和蛋鸡群[9]中都可检测到该毒株。最近，日本也发现了IBDV 新型变异株的流行[10]。由于缺乏抗原性完全匹配的疫苗，IBDV 新型变异株流行范围仍在扩大，已成为养禽业健康发展的新威胁。本研究对地方品种雪山草鸡的某免疫鸡群进行了IBDV 新型变异株的鉴定，以期为IBDV 流行的综合防控提供参考。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 临床样品采集及处理 2020 年9 月，江苏省某鸡场的雪山草鸡出现疑似非典型IBD 症状，发病鸡群为28 日龄，发病鸡生长迟缓，剖检可见法氏囊明显萎缩，其他脏器未出现明显病变。该鸡群于1 日龄免疫过vvIBDV 疫苗。随机采集发病鸡法氏囊3 份，剪取适量组织置于无菌EP 管中，按1 g/mL 的比例加入无菌PBS，于组织研磨器上充分研磨得到组织匀浆，反复冻融3 次后于4 ℃5 000g离心10 min，取上清用于后续检测。

1.1.2 主要试剂 RNAiso Plus，购自大连宝生物工程有限公司；M-MLV 反转录试剂盒，购自美国Invitrogen 公司；2×TaqDNA 聚合酶，购自北京康润诚业生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank 中的IBDV 流行毒株参考序列，设计针对VP2基因高变区和VP1基因代表区段的特异性检测引物（表1），由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物设计

1.2.2 RT-PCR 检测及VP2基因高变区扩增 取200 µL 上述法氏囊组织混悬液上清，依据RNAiso Plus 产品说明书提取组织总RNA，使用M-MLV反转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA。以cDNA为模板，利用针对IBDVVP2基因高变区的特异性引物P1/P2 进行PCR 扩增。PCR 反应程序：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。反应结束后，用1%琼脂糖电泳检测RT-PCR 产物，预期扩增片段的长度为643 bp；然后对RT-PCR 扩增产物进行测序，并将VP2高变区序列上传至GenBank。同时，以本实验室保存的IBDV 弱毒株Gt 株作为阳性对照，以去离子水为阴性对照。

1.2.3VP1基因代表区扩增 以1.2.2 中检测为阳性的样品cDNA 为模板，利用针对IBDVVP1基因代表区段（B-marker）的特异性引物B293U/B1008L 进行PCR 扩增。PCR 反应程序：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。反应结束后，用1%琼脂糖电泳检测RT-PCR 产物，预期扩增片段长度为716 bp；然后对RT-PCR 扩增产物进行测序，并将B-marker 序列上传至GenBank。同时，以本实验室保存的IBDV 弱毒株Gt 株作为阳性对照，以去离子水为阴性对照。

1.2.4 遗传演化分析 依据VP2基因高变区核苷酸序列和VP1基因B-marker 核苷酸序列，运用序列分析软件Clustal X program（version 2.0）进行序列比对，使用软件MAGA6.0 中的最大似然法构建进化树。相关参考毒株及其GenBank 登录号见表2。

2 结果

2.1 RT-PCR 检测

检测结果显示：本批样品的IBDV 阳性率为100%（3/3）。VP2高变区引物扩增出与预期大小一致的目的条带，约为643 bp（图1-A）；VP1B-marker 引物扩增出与预期大小一致的目的条带，约为716 bp（图1-B）。将这3 株IBDV 分别 命 名 为IBDV-JS20-9321、IBDV-JS20-9322 和IBDV-JS20-9325。3 株毒株VP2高变区序列和VP1B-marker 序列的GenBank 登录号分别为：IBDVJS20-9321（MW328552/MW328555）、IBDV-JS20-9322（MW328553/MW328556）、IBDVJS20-9325（MW328554/MW328557）。

表2 相关参考毒株及其GenBank 登录号

图1 IBDV VP2 和VP1 代表区段扩增结果

2.2 遗传演化分析

2.2.1VP2和VP1代表区段遗传进化树分析依据IBDV 基因型分型方法[11]，基于VP2基因高变区核苷酸序列的遗传进化树分析结果显示，IBDV 共分为9 个基因型，血清I 型包含A1—A8 共8 个基因型，其中A2 基因型包括A2a、A2b、A2c 和A2d 共4 个基因亚型。本试验鉴定的IBDV-JS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株 和IBDVJS20-9325 株与IBDV 新型变异株代表毒株SHG19均属于A2 基因型中的A2d 亚型（图2-A）。基于VP1基因B-marker 的核苷酸序列进化树分析结果显示，IBDV 共分为5 个基因型，其中血清I 型包含B1—B4 共4 个基因型，IBDV-JS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株和IBDV-JS20-9325 株与SHG19均属于B1 基因型（图2-B）。综合基因组双节段特征判定，本次鉴定的3 株IBDV 毒株与SHG19毒株处于同一分支，是IBDV 新型变异株，为A2dB1 基因型。

图2 IBDV 基因核苷酸序列遗传进化树分析结果

2.2.2VP2和VP1代表区核苷酸同源性比对

2.2.2.1VP2VP2高变区的核苷酸序列同源性比对结果显示，IBDV-JS20-9321 株、IBDVJS20-9322 株 和IBDV-JS20-9325 株 与A2 基 因型IBDV 毒株（变异株）的同源率较高，为89.6%～98.6%，其中与A2d 基因亚型毒株（新型变异株）的同源性最高，为95.6%～98.6%。进一步比对发现，IBDV-JS20-9321 株和IBDV-JS20-9325株与SHG19 株的同源率均高达98.6%，IBDVJS20-9322 株与SHG19 株的同源率高达98.2%。IBDV-JS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株 和IBDVJS20-9325 株与变异株其他3 个基因亚群A2a、A2b 和A2c 的 同 源 率 分 别 为94.3%～94.5%、93.1%～93.4% 和89.6%～92.0%；与A1 基 因 群（经典毒株）、A3 基因群（超强毒株）和A8 基因群（弱毒株）的同源率分别为89.4%～91.7%、88.0%～90.1% 和90.8～91.7%；与 血 清I 型 其 他4 个基因群（A4、A5、A6 和A7）毒株的同源率 较 低，为84.9%～89.8%。IBDV-JS20-9321 和IBDV-JS20-9325 的同源率为100%，其与IBDVJS20-9322 的同源率为98.6%。

2.2.2.2VP1基于VP1基因代表区段的核苷酸序列同源性比对结果显示，分离毒株（IBDVJS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株 和IBDVJS20-9325 株）与B1 基因型IBDV 毒株的同源率较高，为93.3%～98.8%，其中与IBDV 新型变异株SHG19 同源率最高，可达98.8%；而与B2 基因型（超强毒株）、B3 基因型（HLJ0504 样毒株）以及B4 基因型（过渡型毒株）同源率较低，分别为86.3%～86.5%、87.0%～89.1%和86.5%～87.4%。IBDV-JS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株 和IBDVJS20-9325 株间的同源率为100%。

2.2.3VP2高变区关键氨基酸比对VP2高变区关键氨基酸比对结果（表3）显示，IBDVJS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株 和IBDVJS20-9325 株不仅具有A2 基因型毒株（变异株）共有的4 个特征性氨基酸222T、249K、286I 和318D，还具有A2d 基因亚型毒株（新型变异株）的3 个独特氨基酸221K、252I 和299S。VP2高变区核苷酸比对结果显示，与A2dB1 基因型（新型变异株）代表毒株SHG19 相比，IBDV-JS20-9322株存在14 个核苷酸突变，其中第1 076 位的核苷酸突变引起了VP2 蛋白的氨基酸突变（T359K）；IBDV-JS20-9321 株 和IBDV-JS20-9325 株 虽 然 存在11 个核苷酸突变，但均为无义突变。VP1基因B-marker 核苷酸比对结果显示，分离毒株（IBDVJS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株 和IBDVJS20-9325 株）与SHG19 株相比存在5 个无义核苷酸突变。

3 讨论

2017 年以来，IBDV 新型变异株在我国和日本主要养禽地区广泛流行[8-10，12-13]。IBDV 新型变异株虽然不能致鸡死亡，但在感染后3～5 d 可导致中枢免疫器官法氏囊的急性损伤和免疫抑制，进而造成禽流感等疫苗免疫失败和继发感染以及增重等生产性能明显下滑[10，13]。该毒株导致的亚临床IBD给养禽业造成了严重经济损失。IBDV 新型变异株流行范围不断扩大，在肉鸡群和蛋鸡群中均有流行。雪山草鸡是我国优良的地方品种鸡之一。本研究在地方品种雪山草鸡群中检测到IBDV 新型变异株，但该鸡群曾于1 日龄免疫过用于防控vvIBDV 感染的疫苗。研究[14]发现，新近流行的IBDV 新型变异株与vvIBDV 抗原性不匹配是导致IBDV 新型变异株免疫逃匿并蔓延的重要原因。

IBDV 传统上分为经典株、变异株、超强毒株和弱毒株。这种描述性分类方法已经远远无法涵盖新出现毒株（包括IBDV 新型变异株）的分子特征。最近，一种基于IBDV 基因组双节段特征的IBDV 基因型分类方法[11]被提出：基于A 节段编码的VP2高变区，IBDV 可分为A1—A8 以及AII 等9 个基因型；基于B 节段编码的VP1B-marker，IBDV 可 分 为B1—B4 以 及BII 等5 个基因型；每个毒株可综合A、B 的分子特征进行基因型分类。在该分型系统里，变异株被归类于A2B1 基因型。该基因型又分为4 个基因亚型，即A2aB1、A2bB1、A2cB1 和A2dB1。遗传演化分析发现，本研究在雪山草鸡上鉴定的IBDV 毒株（IBDV-JS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株 和IBDV-JS20-9325 株）与IBDV 新型变异株代表毒株SHG19 处于同一个分支，为A2dB1 基因型。与早期在北美洲流行的变异株不同，这3 个毒株的VP2高变区编码蛋白上含有IBDV 变异株的特征性氨基酸，也具有IBDV 新型变异株的独特氨基酸。氨基酸222T、249K、286I 和318D 已被证明与IBDV 抗原变异密切相关[15-16]，而氨基酸221K、252I 和299S 的生物学意义尚待进一步研究。

表3 IBDV VP2 基因高变区关键氨基酸比对结果

IBDV 新型变异株在肉鸡、蛋鸡和地方品种鸡的免疫鸡群中不断蔓延，已经成为包括我国和日本在内的东亚地区养禽业的重要威胁，其遗传演化规律研究以及新疫苗的创制研究对IBDV 流行的综合防控和养禽业健康发展具有重要意义。