N-乙酰半胱氨酸对PM2.5引起HaCaT细胞损伤的保护作用

李锦濯 林志鹏 曾倩雯 孙仁山

陆军军医大学大坪医院皮肤科，重庆，400042

PM2.5是大气悬浮颗粒物(particulate matter, PM)中的细颗粒物，空气动力学直径≤2.5 μm，其粒径小，危害大，是空气污染重要的监测指标。随着全球经济快速发展，空气污染严重，PM2.5污染引发的健康问题也受到广泛关注，我国于2012年制定了PM2.5的空气质量标准[1]。PM2.5可以长时间悬浮于空气中，表面富集有多种有害物质，其主要成分为：NH4+、SO42-、NO3-等无机盐，多环芳烃等有机物，有机碳、无机碳等含碳组分，多种重金属元素以及一些致病微生物[2]。

流行病学研究报道PM2.5可以影响呼吸系统[3]和心血管系统[4]疾病的发病率和死亡率。皮肤作为机体最大的器官，长期处于环境PM2.5中，PM2.5中含有脂溶性成分如多环芳烃等，容易渗透进入皮肤[5]。目前研究认为，PM2.5中的有毒物质既可以直接经皮吸收，也可以经过呼吸系统进入人体后通过血液循环到达皮肤，进而诱导皮肤细胞氧化应激，激活细胞内多种炎症信号通路，导致皮肤损伤[6]。角质形成细胞在皮肤炎症反应的启动与加重过程中发挥重要作用，与多种炎症性皮肤病的发生发展密切相关。本课题组前期发现PM2.5可降低HaCaT细胞存活率，促进细胞凋亡，且可能通过诱导NF-κB信号通路活化进而上调CCL20表达[7]，但PM2.5导致皮肤细胞损伤的具体机制以及如何进行防治尚不清楚。NAC作为一种高效的抗氧化剂，可以清除细胞内活性氧自由基来降低氧化应激状态，通过研究NAC是否对PM2.5诱导的HaCaT细胞损伤发挥保护作用，探讨氧化应激在PM2.5诱导的HaCaT细胞损伤中可能的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 CO2培养箱(美国Thermo)、倒置显微镜(日本OLYMPUS IX70)、SpectraMax i3x多功能酶标仪(美国Molecular Devices)、CFX Connect real-time PCR仪(美国BIO-RAD)、ChemiDocTM Touch Imaging System化学发光成像仪(美国BIO-RAD)、NanoDrop2000超微量核酸蛋白测定仪(美国Thermo)等。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基(SH30022美国Hyclone)、ROS试剂盒(S0033S上海碧云天)、CCK-8试剂盒(CK04日本同仁)、ELISA试剂盒(E-EL-H0149c H1598c H2402c武汉Elabscience)、NAC(S0077上海碧云天)、Phospho-NF-κB p65 Rabbit mAb(3033美国CST)、NF-κB p65 Rabbit mAb(8242美国CST)、重组Anti-GAPDH抗体(ab181602美国abcam)、RT-PCR引物(上海生工)、SYBR Green试剂盒(QPK-201日本toyobo)等。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5混悬液制备 PM2.5收集膜由重庆市生态环境监测中心馈赠。将收集好PM2.5的滤膜剪成小块，放入试管，加三蒸水，超声震荡5 h，收集震荡液后过滤。滤液移至平皿，真空冷冻干燥48 h后收集絮状产物，-20℃储存。称取适量颗粒物，超净工作台内紫外照射30 min，用无菌PBS配成10 mg/mL的储存液，4℃储存。实验前用培养液稀释成不同浓度PM2.5混悬液(0～400 μg/mL)。

1.2.2 细胞培养 HaCaT细胞由重庆市陆军军医大学防原教研室馈赠。采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃，5% CO2细胞培养箱中培养细胞，使用0.25%胰酶进行消化传代。取对数生长期，稳定生长的HaCaT细胞进行实验。

1.2.3 实验分组与NAC干预 实验分组：对照组和实验组。对照组：PM2.5浓度为：0 μg/mL。实验组：不同浓度PM2.5刺激实验：设五个PM2.5浓度：25、50、100、200、400 μg/mL。NAC干预实验：PM2.5浓度为：200 μg/mL，NAC干预浓度：细胞增殖实验为2.5、5、10 mmol/L，根据细胞增殖实验结果，其余干预实验NAC浓度均为5 mM。每组至少设三个平行孔。

NAC干预：NAC干预组用DMEM配制相应浓度的NAC工作液预处理1 h，其余各组加同等剂量的DMEM。随后NAC干预组及PM2.5组细胞再予以200 μg/mL浓度的PM2.5混悬液刺激24 h，对照组给予同等剂量的DMEM全培养液孵育24 h，再进行后继实验。

1.2.4 DCFH-DA探针法检测ROS 选取对数生长期的HaCaT细胞，消化离心重悬后，细胞接种96孔板，待细胞融合至80%左右，弃培养基。根据1.2.3实验分组，PM2.5染毒24 h，弃培养基。缓冲液洗涤，避光条件加入100 μL DCFH-DA(浓度：10 μmol/L)，在37℃下CO2培养箱中孵育20 min。缓冲液冲洗3次，采用多功能酶标仪检测荧光强度。以实验组与对照组荧光值之比表示ROS相对水平。

1.2.5 CCK-8法检测细胞存活率 细胞接种96孔板，PM2.5染毒24 h后，弃培养基。PBS洗涤3次，加100 μL含l0%胎牛血清的DMEM培养基及10 μL CCK-8检测试剂，孵育2 h。使用酶标仪在450 nm模式下检测光密度值(OD值)。细胞存活率(%)=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×l00%。

1.2.6 RT-PCR法检测炎症因子mRNA表达水平 细胞接种于6孔板，PM2.5染毒24 h后，提取总RNA。根据逆转录试剂盒步骤说明，逆转录合成cDNA。SYBR Green法检测IL-1β、TSLP、IL-33的mR-NA表达水平。PCR运行程序为：95℃ 3 min，95℃ 10 s，58℃ 5 s，72℃ 20 s，40个循环。以GAPDH为内参，分析目的基因的相对表达量。引物见表1。

表1 RT-PCR引物

1.2.7 ELISA法检测炎性因子分泌水平 细胞接种于12孔板，PM2.5染毒24 h后，收集细胞培养上清液：离心，取上清液。按照试剂盒操作说明，检测上清液中IL-1β、TSLP、IL-33水平。

1.2.8 Western blot法检测NF-κB信号通路相关蛋白 细胞接种于6孔板，PM2.5染毒24 h后，加入RIPA裂解液提取蛋白。根据Western blot操作方法进行上样，电泳，转膜，封闭，免疫反应，显影。用Image J软件分析蛋白灰度值，以p-p65与p65灰度值之比来表示蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 不同浓度PM2.5对HaCaT细胞生成ROS水平的影响 暴露于25 μg/mL PM2.5后，HaCaT细胞内ROS生成水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，50～400 μg/mL浓度组细胞内ROS水平显著高于对照组(P<0.01)，且ROS水平呈浓度梯度性增高，400 μg/mL浓度组细胞内ROS生成水平最高。表明PM2.5诱导HaCaT细胞内ROS产生增多，导致细胞内氧化应激反应(图1)。

2.2 不同浓度PM2.5对HaCaT细胞表达及分泌炎症因子的影响 如图2a所示，与对照组比较，HaCaT细胞内炎性因子IL-1β、IL-33、TSLP mRNA表达水平，暴露于较高PM2.5浓度(200、400 μg/mL)后，均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；如图2b所示，与对照组比较，当PM2.5刺激浓度≥50 μg/mL时，HaCaT细胞分泌IL-1β水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；当PM2.5刺激浓度≥25 μg/mL，HaCaT细胞分泌TSLP、IL-33水平显著增高(P<0.01)。

图1 不同浓度PM2.5刺激后HaCaT细胞生成ROS水平与对照组(0 μg/mL)比较，*P<0.05，**P<0.01

图2 不同浓度PM2.5刺激后炎症因子mRNA表达水平及其分泌浓度与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.3 NAC干预后，PM2.5对HaCaT细胞增殖活性的影响 对照组HaCaT细胞存活率为(100±3.718)%，200 μg/mL PM2.5组细胞存活率为(74.88±3.487)%，与对照组相比，PM2.5组存活率显著降低(P<0.01)；不同浓度NAC预处理细胞1 h，继而用200 μg/mL PM2.5颗粒染毒24 h，2.5 mM NAC干预组存活率与PM2.5组比较无明显差别；5 mM、10 mM NAC干预组存活率分别为(87.92±3.034)%，(86.98±2.223)%，与PM2.5组比较，存活率均明显增高(P<0.05)，但仍低于对照组存活率，表明NAC可以部分拮抗PM2.5对HaCaT细胞增殖的抑制作用(图3)。细胞存活率随NAC浓度升高而逐渐增高，5 mM NAC提高细胞活力最明显，后续实验将5 mM作为的NAC干预组工作液浓度。

2.4 NAC干预后，PM2.5对HaCaT细胞ROS生成水平的影响 与对照组比较，PM2.5组HaCaT细胞产生ROS水平显著增高(P<0.01)；与PM2.5组比较，NAC干预组ROS水平显著降低(P<0.01)，减少约43.35%。但仍高于对照组ROS水平，表明NAC可以部分降低PM2.5诱导的ROS生成(图4)。

2.5 NAC干预后，PM2.5对HaCaT细胞分泌炎症因子水平的影响 与对照组相比，PM2.5组HaCaT细胞分泌IL-1β、TSLP、IL-33水平显著增高(P<0.01)；与PM2.5组相比，NAC干预组细胞分泌IL-1β、TSLP、IL-33水平显著降低(P<0.05)，但仍高于对照组水平，表明NAC可以部分降低PM2.5诱导HaCaT细胞分泌IL-1β、TSLP、IL-33的水平(表2)。

表2 NAC干预后HaCaT细胞分泌炎症因子水平

2.6 NAC干预后，PM2.5对HaCaT细胞表达NF-κB信号通路相关蛋白的影响 与对照组比较，PM2.5组细胞内NF-κB p-p65蛋白表达水平显著上调(P<0.01)，提示PM2.5可以激活细胞内NF-κB信号通路；与PM2.5组相比，NAC干预组NF-κB p-p65蛋白表达水平显著下调(P<0.05)，但仍高于对照组水平，表明NAC可以部分降低PM2.5诱导的HaCaT细胞内NF-κB p-p65蛋白表达水平(图5)。

图3 NAC干预后HaCaT细胞存活率与对照组比较，**P<0.01，与PM2.5组(200 μg/mL)比较，#P<0.05

3 讨论

研究表明PM2.5与特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)、痤疮、湿疹等炎症性皮肤病以及皮肤老化密切相关[8]。Kim等[9]发现PM2.5浓度与AD症状之间呈正相关，PM2.5每增加1 μg/m3，特应性皮炎症状增加0.67%。课题组通过meta分析发现PM2.5浓度每增高10 μg/m3，对过敏性皮肤病影响的合并效应量为1.0066(95%CI：1.0033～1.0100)，亚组分析发现PM2.5对AD影响的合并效应量为1.0320(95%CI：1.0056～1.0590)，对湿疹影响的合并效应量为1.0066(95%CI：1.0029～1.0103)，表明PM2.5会一定程度增加AD以及湿疹的发病率[10]。研究还发现环境中PM2.5浓度升高与寻常痤疮门诊量的增加显著相关[11]。暴露于高浓度的PM2.5还可导致皮肤老化明显，面部出现更多的色素斑，并增加鼻唇沟褶皱[12]。

PM2.5诱导氧化应激和炎症级联反应是其皮肤损伤的主要机制，而抗氧化剂和抗炎药物可能是针对PM2.5引起的皮肤损伤的防治药物[13]。氧化应激是PM2.5诱导细胞产生的主要损伤效应，ROS是一种常用的反映氧化应激的指标。ROS是一组含氧的高度活性的化学物质，由氧代谢产生，包括羟基自由基、超氧阴离子、过氧化物、单线态氧等[14]。ROS作为细胞内信号分子，与细胞增殖及凋亡密切相关，同时参与许多炎症相关信号通路如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路和NF-κB信号通路的激活[15]。过量的ROS通过损伤脂质、蛋白质和DNA等生物大分子，引起细胞器应激，导致细胞氧化损伤[16]。本研究结果显示，ROS生成水平呈PM2.5浓度依赖性增高，提示PM2.5能引起细胞内氧化应激反应，与Piao等[17]研究结果，PM2.5引起HaCaT细胞内ROS生成增多，导致细胞损伤一致。

炎症反应是PM2.5诱导细胞产生的另一种损伤效应。NF-κB是PM2.5引起炎性损伤过程中较早出现的转录因子，可以入核调控TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β等多种炎症因子的基因转录[18]。这些炎症因子进而可以招募或激活不同类型的免疫细胞，如记忆T细胞和效应T细胞及朗格汉斯细胞等，从而调节免疫反应[19]。氧化应激与炎症反应是紧密相关的过程，在PM2.5诱导的炎症反应中，氧化应激起主要作用，NF-κB能被多种刺激因素激活，ROS为重要因素之一。一方面PM2.5通过产生ROS诱导NF-κB激活，进而释放下游炎性因子，启动炎症因子的级联反应，导致广泛的炎症损伤；另一方面，NF-κB反过来诱导ROS和NO产生[20]。本研究发现，PM2.5刺激后细胞内NF-κB p-p65蛋白表达水平较对照组显著增高(P<0.01)，提示细胞内NF-κB信号通路激活。随着PM2.5刺激浓度增高，炎症因子IL-1β mRNA表达水平及分泌浓度呈逐渐升高趋势。IL-1β的转录受NF-κB信号通路调控，IL-1β可诱导免疫细胞的浸润及其他炎症因子的生成，引起炎性损伤。IL-1β与IL-1受体I(IL-1R I)结合发挥作用，IL-1R I在许多靶细胞上表达，IL-1β通过上调淋巴细胞IL-2受体、促进B细胞增殖或促进辅助性T细胞17(Th17)分化等途径参与调节免疫反应[21]。皮肤中IL-1信号传导对于皮肤的内环境稳态是必不可少的，证据表明，IL-1β参与许多炎症性皮肤病的发病机制[22]。

TSLP、IL-33是过敏反应相关的细胞因子，主要通过激活DC细胞，促进Th2型过敏反应，与AD等过敏性疾病密切相关。研究认为AD易感人群角质形成细胞受外界环境因素影响表达TSLP、IL-33等多种关键炎症因子增多，继而通过激活皮肤DC细胞，激活并诱导Th2细胞产生IL-4, IL-13,IL-31等细胞因子，反过来作用于角质形成细胞，形成炎症循环，在AD的发病机制中至关重要[23]。本研究结果显示，随着PM2.5刺激浓度增高，炎症因子TSLP、IL-33 mRNA表达水平及分泌浓度呈逐渐升高趋势，与姚骐羽等[24]研究结果一致，姚骐羽等研究发现PM2.5诱导人原代角质形成细胞表达TSLP、IL-33、IL-1α上调，引起细胞内皮肤屏障相关蛋白表达改变，可能导致皮肤屏障损伤。

为探究氧化应激与PM2.5诱导的细胞增殖及炎症反应改变之间的关系，我们采用抗氧化剂NAC作为干预条件。NAC是细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)的前体，可以促进细胞内GSH合成，减少ROS的生成，清除已生成的ROS，发挥抗氧化应激的作用，维持细胞氧化还原状态平衡[25]。课题组前期研究发现，PM2.5引起HaCaT细胞增殖受限，凋亡率增高，NF-κB p-p65蛋白表达逐渐上调，呈浓度依赖性，当PM2.5浓度为200 μg/mL时对HaCaT细胞造成的损伤较为明显[7]。因此，本研究中NAC干预实验PM2.5浓度定为200 μg/mL，结果显示NAC干预后，细胞内ROS生成水平减少，细胞存活率增高，同时NAC还可以显著抑制PM2.5诱导的NF-κB的活化及IL-1β、TSLP、IL-33分泌水平。NAC干预实验结果间接表明PM2.5诱导的细胞增殖抑制，NF-κB信号激活，IL-1β、TSLP、IL-33表达上调可能与其引起的细胞氧化应激有关。本实验结果与Wang等[26]研究一致，Wang等发现PM诱导支气管上皮细胞内ROS生成增多，并且激活MAPK信号通路和NF-κB信号通路，导致IL-1β、IL-6、IL-8的表达上调，而NAC干预可以显著减少ROS生成并抑制MAPK和NF-κB通路的激活以及IL-1β、IL-6、IL-8的表达，结果表明氧化应激是PM诱导肺部炎症反应的关键因素。而课题组既往研究表明NAC可以抑制PM2.5诱导的肥大细胞内ROS生成及肥大细胞活化脱颗粒释放IL-4和β-Hex[27]。此外，Zhen等[28]发现抗氧化药物烟酰胺可以抑制PM2.5诱导的HaCaT细胞内ROS生成，进而减轻PM2.5诱导的如脂类、蛋白质和DNA分子氧化及细胞凋亡。Jin等[29]研究表明NAC可以减弱PM诱导的角质形成细胞以及小鼠皮肤的炎症，认为PM导致的皮肤炎症反应与ROS密切相关。这些研究结果均提示应用抗氧化剂可以保护细胞对抗PM2.5引起的氧化损伤及炎症损伤。

综上，本研究发现PM2.5可以诱导HaCaT细胞内ROS生成增多，抑制细胞增殖，引起细胞内NF-κB信号通路激活及炎症因子IL-1β、TSLP 、IL-33表达上调，这可能是PM2.5导致皮肤炎症损伤的病理机制之一。抗氧化剂NAC可以在一定程度上拮抗PM2.5引起的细胞增殖抑制和炎症反应，表明氧化应激与PM2.5诱导的细胞损伤密切相关，而NAC可以作为一种有效的保护剂，这为进一步研究PM2.5引起皮肤损伤的机制及其防治提供了参考。