白背飞虱若虫和雄雌成虫唾液腺蛋白鉴定

李 飞, 易金玉, 刘玉娣, 侯茂林

(中国农业科学院植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京100193)

白背飞虱Sogatellafurcifera是我国最重要的水稻刺吸式害虫之一，若虫与成虫不仅通过口针刺吸稻株韧皮部汁液为害，还能传播多种病毒病，对我国水稻种植产生了严重的危害(沈君辉等, 2003)。刺吸式昆虫在漫长的进化过程中形成了有利于取食的口针结构，下颚特化成细长的口针，下唇延长形成喙(刘勇等, 2011)。刺吸式口器昆虫的唾液可起帮助昆虫取食、抑制植物防御反应、润滑和保护口针等作用(Sharmaetal., 2014)。

唾液腺是昆虫产生唾液大分子物质尤其是唾液蛋白的重要器官，黄海剑(2017)对灰飞虱Laodelphaxstriatellus、褐飞虱Nilaparvatalugens及白背飞虱3种飞虱唾液腺高表达基因进行分析发现飞虱唾液腺大量合成分泌蛋白，而这些蛋白很可能参与昆虫-植物之间的互作。Su等(2012)用高通量测序技术获得B型烟粉虱Bemisiatabaci唾液腺的转录组，分析得到了与分泌和传毒有关的基因。褐飞虱唾液腺所分泌的唾液蛋白NI1860能够影响褐飞虱的取食行为，在褐飞虱的致害性变异中发挥着重要作用(纪锐, 2013)。有研究显示蚜虫唾液腺存在与大麦黄矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus)传递相关的蛋白(王锡锋和周广和, 2003)。豌豆蚜Acyrthosiphonpisum唾液腺含分泌蛋白Armet和ACE，二者是具有调控作用的效应分子，在昆虫与植物的相互作用中起重要的作用(王炜, 2014)。马琳(2015)对角倍蚜Schlechtendaliachinensis唾液腺蛋白通过蛋白质组学方法进行检测与鉴定，发现唾液腺中有4类特异性蛋白与致瘿相关。邓瑶等(2018)对白背飞虱唾液腺转录组测序发现，感染南方水稻黑条矮缩病毒(Southernriceblack-stripeddwarfvirus)的白背飞虱有89个基因的表达发生了上调或下调的变化。白背飞虱唾液腺组织分泌唾液通过刺吸水稻造成危害，唾液腺蛋白与其取食为害和传毒息息相关。

本研究通过液相色谱串联质谱对白背飞虱唾液腺蛋白进行鉴定，与Unigene的蛋白数据库进行比对，再通过KOG(Eukaryotic Orthologous Groups of Proteins)分析，KOG可对真核细胞蛋白进行完整全面地分类，与GO和KEGG比较，KOG数据库提供的蛋白类别更多(Nieetal., 2015)。利用KOG数据库(http: ∥www.ncbi.nlm.nih.gov/KOG)将鉴定的唾液腺组织蛋白分为信息存储和处理(information storage and processing)、细胞过程和信号传导(cellular processes and signaling)、新陈代谢(metabolism)以及表征欠佳(poorly characterized)4类进行蛋白功能分类，在此4大类下又分25个小类，再从25个小类中具体对比到某一个或类相关蛋白名称。本研究将白背飞虱若虫、雄成虫和雌成虫的唾液腺蛋白分别进行鉴定和KOG功能分类，对比分析不同发育阶段和不同性别的白背飞虱唾液腺蛋白，从而为其防治提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 试虫饲养

实验所用初始白背飞虱种群采自农业部桂林作物有害生物科学观测实验站，用TN1水稻置于培养箱中饲养，饲养条件：温度27±1℃，相对湿度75%±5%，光周期16L∶8D。所用试虫已在人工气候箱内连续饲养10代以上。

1.2 试虫唾液腺蛋白提取

将白背飞虱若虫和雌雄成虫在冰上麻醉，无菌培养皿上解剖分离出唾液腺组织，收集各约400头作为试验样本，提取唾液腺组织，将收集的组织样本置于离心管中，加入蛋白酶抑制剂Cocktail，进行离心，取上清溶液，向沉淀中加入500 μL裂解液，冰上超声2 min，4℃旋转裂解30 min，再4℃离心取上清溶液，将两次上清溶液加入超滤管中，进行超滤至液体剩余0.1 mL左右，得到样品蛋白。取出20 μL样品上样，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，染色。

1.3 唾液腺样品蛋白还原烷基化和酶解

各取1.2节蛋白样品25 μL，用裂解液补充体积到50 μL，加入终浓度20 mmol/L二硫苏糖醇(dithiothreitol, DTT)在37℃下反应60 min；加入终浓度40 mmol/L碘乙酰胺(iodoacetamide)室温下避光反应40 min；每管各加入预冷的丙酮(丙酮∶样品=6∶1, v/v)，-20℃沉淀2 h；10 000 g离心20 min，取沉淀；用50 μL 100 mmol/L四乙基溴化铵(TEAB)充分溶解样品；按照质量比1∶25(酶∶蛋白)加入胰蛋白酶(trypsin)在37℃酶解过夜。

1.4 肽段的液相色谱串联质谱分析

将酶解的肽段复溶，用Sep-Pak进行肽段脱盐，真空浓缩仪抽干；用质谱上样缓冲液溶解，通过串联质谱仪(Thermofishier Scientific)进行质谱分析。色谱分离时间为180 min，缓冲液A： 2% ACN(含0.1%甲酸)，缓冲液B：80% ACN(含0.1%甲酸)，流速为300 nL/min，MS扫描范围(m/z)350～1 300，采集模式DDA，机器设置一级质谱分辨率70 000(质荷比/半峰宽)，碎裂方式HCD，二级分辨率17 500，动态排除时间30 s。

1.5 唾液腺蛋白鉴定及KOG功能注释

对质谱原始数据进行峰识别，得到峰列表，建立Unigene.blast.pep.fasta数据库，利用Proteome DiscovererTMSoftware 2.1软件将质谱鉴定到的蛋白比对到Unigene.blast.pep.fasta数据库，查库时将Raw文件提交至Proteome Discoverer服务器，选择已经建立好的数据库，然后进行数据库搜索。Proteome Discoverer服务器中Precursor Mass Tolerance设置为10 ppm，Fragment Mass Tolerance设置为0.05 Da，结果过滤参数为Peptide FDR≤0.01。

COG(Cluster of Orthologous Groups of Proteins)由NCBI创建并维护的蛋白数据库，根据细菌、藻类和真核生物完整基因组的编码蛋白系统进化关系分类构建而成。通过blast比对String数据库，可以将某个蛋白序列注释到某一个COG中，每一簇COG由直系同源序列构成，从而可以推测该序列的功能。COG分为原核生物和真核生物，真核生物的称为KOG数据库。根据UniProt数据库中ID mapping将本次鉴定到的蛋白UniProt编号获得相应KOG编号，然后根据KOG数据库进行蛋白质功能注释。

2 结果

2.1 白背飞虱唾液腺蛋白鉴定

通过液相色谱串联质谱对白背飞虱唾液腺蛋白进行鉴定，与Unigene的蛋白数据库进行比对，鉴定出白背飞虱若虫样本的唾液腺肽段数量为10 024个，蛋白数量为2 599个；白背飞虱雄成虫样本的唾液腺肽段数量为8 195个，蛋白数量为2 331个；白背飞虱雌成虫样本的唾液腺肽段数量为5 597个，蛋白数量为1 898个。其中，白背飞虱若虫特有的唾液腺蛋白数量为385个，白背飞虱雄成虫特有的唾液腺蛋白数量为168个，白背飞虱雌成虫特有的唾液腺蛋白数量为82个；白背飞虱若虫与雄成虫含有相同唾液腺蛋白数量为319个，白背飞虱若虫与雌成虫含有相同唾液腺蛋白数量为60个，白背飞虱雄成虫与雌成虫含有相同唾液腺蛋白数量为60个。白背飞虱不同发育阶段与不同性别的唾液腺蛋白具有一定的差异。

对白背飞虱唾液腺蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果显示大部分蛋白分子量分布在30～120 kD(图1)。

图1白背飞虱唾液腺蛋白SDS-PAGE图Fig. 1 SDS-PAGE of salivary gland proteinsof Sogatella furciferaM: 预染的蛋白质分子量标准Pre-stained protein ladder; 1: 雄成虫Male adult; 2: 雌成虫Female adult; 3: 若虫Nymph.

2.2 若虫、雄成虫和雌成虫两两之间共有蛋白的KOG功能注释

2.2.1若虫和雄成虫共有唾液腺蛋白的KOG功能注释：根据鉴定到的蛋白UniProt编号获得相应KOG编号，然后对比KOG数据库进行蛋白功能注释，KOG功能注释将蛋白分为4大类——信息存储与处理、细胞过程与信号传导、新陈代谢以及表征欠佳，4大类又细分为25个小类。白背飞虱若虫和雄成虫共有唾液腺蛋白KOG功能注释分析结果显示，在319个蛋白中对比到162个具有KOG注释蛋白，其中参与信息存储与处理的蛋白数量为27个、参与细胞过程和信号传导的蛋白数量为70个、参与新陈代谢的蛋白数量为38个，另有31个蛋白表征欠佳(图2)。在25个小类中蛋白数量排在前三的是翻译后修饰、蛋白质更新、伴侣蛋白(KOG类别为O)，信号转导机制(KOG类别为T)，细胞内运输、分泌和囊泡运输(KOG类别为U)。白背飞虱若虫和雄成虫共有的唾液腺蛋白在信号转导机制方面表现较为活跃。

图2 白背飞虱若虫和雄成虫共有唾液腺蛋白KOG功能注释Fig. 2 KOG functional annotation of salivary gland proteins shared by nymphs and male adults of Sogatella furciferaA: RNA加工与修饰RNA processing and modification; B: 染色质结构与动力学Chromatin structure and dynamics; J: 翻译、核糖体结构和生物发生Translation, ribosomal structure and biogenesis; K: 转录Transcription; L: 复制、重组和修复Replication, recombination and repair; D: 细胞周期控制、细胞分裂、染色体分割Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; M: 细胞壁/膜/包膜生物起源Cell wall/membrane/envelope biogenesis; O: 翻译后修饰、蛋白质更新、伴侣蛋白Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; T: 信号转导机制Signal transduction mechanisms; U: 细胞内运输、分泌和囊泡运输Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; Y: 核结构Nuclear structure; Z: 细胞骨架Cytoskeleton; C: 能源生产和转换Energy production and conversion; E: 氨基酸运输和代谢Amino acid transport and metabolism; F: 核苷酸运输和代谢Nucleotide transport and metabolism; G: 碳水化合物运输和代谢Carbohydrate transport and metabolism; H: 辅酶运输和代谢Coenzyme transport and metabolism; I: 脂质运输和代谢Lipid transport and metabolism; P: 无机离子转运和代谢Inorganic ion transport and metabolism; Q: 次生代谢产物生物合成、运输和分解代谢Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism; R: 仅一般功能预测General function prediction only; S: 功能未知Function unknown.

2.2.2若虫和雌成虫共有唾液腺蛋白的KOG功能注释：对白背飞虱若虫和雌成虫共有唾液腺蛋白进行KOG功能注释分析，在60个蛋白中对比到33个具有KOG注释蛋白。其中参与信息存储与处理的蛋白数量为5个、参与细胞过程和信号传导的蛋白数量为19个、参与新陈代谢的蛋白数量为3个，另有6个蛋白表征欠佳(图3)。在25个小类中蛋白质数量排在前三的是信号转导机制(KOG类别为T)，翻译后修饰、蛋白质更新、伴侣蛋白(KOG类别为O)，细胞内运输、分泌和囊泡运输(KOG类别为U)。白背飞虱若虫和雌成虫共有的唾液腺蛋白在信号转导机制方面表现较为活跃。

图3 白背飞虱若虫和雌成虫共有唾液腺蛋白KOG功能注释Fig. 3 KOG functional annotation of salivary gland proteins shared by nymphs and female adults of Sogatella furciferaA: RNA加工与修饰RNA processing and modification; B: 染色质结构与动力学Chromatin structure and dynamics; J: 翻译、核糖体结构和生物发生Translation, ribosomal structure and biogenesis; O: 翻译后修饰、蛋白质更新、伴侣蛋白Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; T: 信号转导机制Signal transduction mechanisms; U: 细胞内运输、分泌和囊泡运输Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; Y: 核结构Nuclear structure; Z: 细胞骨架Cytoskeleton; C: 能源生产和转换Energy production and conversion; E: 氨基酸运输和代谢Amino acid transport and metabolism; G: 碳水化合物运输和代谢Carbohydrate transport and metabolism; I: 脂质运输和代谢Lipid transport and metabolism; R: 仅一般功能预测General function prediction only; S: 功能未知Function unknown.

2.2.3雄成虫和雌成虫共有唾液蛋白的KOG功能注释：对白背飞虱若虫和雄成虫共有唾液腺蛋白进行KOG功能注释分析，在60个蛋白中对比到21个具有KOG注释蛋白质。其中参与信息存储与处理的蛋白数量为3个、参与细胞过程和信号传导的蛋白数量为12个、参与新陈代谢的蛋白数量为3个，另有3个蛋白表征欠佳(图4)。白背飞虱雄雌成虫共有唾液腺蛋白在信号转导机制方面表现较为活跃。

图4 白背飞虱雄成虫和雌成虫共有唾液腺蛋白KOG功能注释Fig. 4 KOG functional annotation of salivary gland proteins shared by male and female adults of Sogatella furciferaA: RNA加工与修饰RNA processing and modification; J: 翻译、核糖体结构和生物发生Translation, ribosomal structure and biogenesis; M: 细胞壁/膜/包膜生物起源Cell wall/membrane/envelope biogenesis; O: 翻译后修饰、蛋白质更新、伴侣蛋白Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; T: 信号转导机制Signal transduction mechanisms; U: 细胞内运输、分泌和囊泡运输Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; V: 防御机制Defense mechanisms; W: 细胞外结构Extracellular structures; Z: 细胞骨架Cytoskeleton; F: 核苷酸运输和代谢Nucleotide transport and metabolism; G: 碳水化合物运输和代谢Carbohydrate transport and metabolism; I: 脂质运输和代谢Lipid transport and metabolism; R: 仅一般功能预测General function prediction only; S: 功能未知Function unknown.

2.3 白背飞虱若虫、雄成虫和雌成虫特有唾液腺蛋白KOG功能注释

2.3.1白背飞虱若虫特有唾液腺蛋白KOG功能注释：在385个白背飞虱若虫唾液腺特有蛋白中比对到181个具有KOG功能注释的蛋白，其中参与信息存储与处理的蛋白数量为37个、参与细胞过程和信号传导的蛋白数量为81个、参与新陈代谢的蛋白数量为39个，另有35个蛋白表征欠佳(表1)。在25个小类中蛋白数量排在前三的是翻译后修饰、蛋白质更新、伴侣蛋白(KOG类别为O)，信号转导机制(KOG类别为T)，细胞内运输、分泌和囊泡运输(KOG类别为U)。白背飞虱若虫特有唾液腺蛋白在信号转导机制方面表现较为活跃。

2.3.2白背飞虱雄成虫特有唾液腺蛋白KOG功能注释：在168个白背飞虱雄成虫唾液腺特有蛋白中比对到64个具有KOG功能注释的蛋白，其中参与信息存储与处理的蛋白数量为15个，参与细胞过程和信号传导的蛋白数量为22个，参与新陈代谢的蛋白数量为13个，另有15个蛋白表征欠佳。雄成虫特有唾液腺蛋白参与细胞过程和信号传导中信号转导机制(KOG类别为T)的数量最多，鉴定到有磷脂酰肌醇4-激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶调节亚基、钙离子端依赖激活蛋白、G蛋白亚基、ADP核糖基化因子相关蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、蛋白质磷酸酶2C/丙酮酸脱氢酶(脂酰胺)磷酸酶、丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白磷酸酶PP1催化亚基(表2)。白背飞虱雄成虫特有唾液腺蛋白在信号转导机制方面表现较为活跃。

2.3.3白背飞虱雌成虫特有唾液腺蛋白KOG功能注释：在82个白背飞虱雌成虫唾液腺特有蛋白中比对到24个具有KOG功能注释的蛋白，其中参与信息存储与处理的蛋白数量为4个，参与细胞过程和信号传导的蛋白数量为13个，参与新陈代谢的蛋白数量为4个，另有4个蛋白表征欠佳。雌成虫特有唾液腺蛋白参与细胞过程和信号传导中信号转导机制(KOG类别为T)，翻译后修饰、蛋白质更新、伴侣蛋白(KOG类别为O)，细胞内运输、分泌和囊泡运输(KOG类别为U)的数量排在前三，其次是新陈代谢机制和信息存储和处理机制(表3)。白背飞虱雌成虫特有唾液腺蛋白在信号转导机制方面表现较为活跃。

3 讨论

白背飞虱在取食过程中唾液腺会产生和分泌两种唾液：一种是胶状唾液，形成唾液鞘，保护口针避免机械损伤和化学攻击；另一种是水状唾液，在昆虫刺穿植物组织时分泌，润滑口针和传导酶液(Sharmaetal., 2014)。白背飞虱从若虫期到成虫期均以刺吸水稻韧皮部汁液的方式取食为害。

本研究通过液相色谱串联质谱技术对白背飞虱唾液腺蛋白进行鉴定，与Unigene的蛋白数据库进行比对，对鉴定的蛋白进行分类整理，归纳出白背飞虱若虫、雄成虫、雌成虫特有的唾液腺蛋白，以及若虫与雄成虫、若虫与雌成虫、雄成虫与雌成虫两两共有的唾液腺蛋白。KOG功能分类显示6个蛋白类别下，唾液腺蛋白参与细胞过程和信号传导功能表现最为活跃，蛋白数量占比最多，在这一类别下蛋白质主要参与翻译后修饰、蛋白质更新、伴侣蛋白(KOG类别为O)，信号转导机制(KOG类别为T)，细胞内运输、分泌和囊泡运输(KOG类别为U)(图2-4)。KOG功能注释可对真核细胞蛋白进行完整全面的分类，与GO注释和KEGG注释比较，KOG数据库提供的蛋白类别更多(Nieetal., 2015)。本研究将鉴定到的蛋白UniProt编号获得相应KOG编号，然后对比KOG数据库进行蛋白质功能注释。若无匹配结果，这可能与序列片段过短和缺乏注释信息有关(魏利斌等, 2012)。信号转导是指在遇到外源性信号时及时改变各种分子活性，改变细胞功能，使机体在整体上对外界环境的变化发生最为适宜的反应。白背飞虱唾液腺蛋白参与信号转导机制表现活跃，推测可能是在取食中遇到外源刺激时，能使机体快速做出积极响应，更高效地吸收营养物质，并进行储存。KOG分析信号转导机制中蛋白质多数属于受体丝氨酸/苏氨酸激酶及相关蛋白，此类蛋白激酶在信号转导通路中有一定的关键性作用。有研究在蚊子中鉴定到3种丝氨酸/苏氨酸激酶，它们可能参与了细胞或体液免疫的调节(Chiouetal., 1998)。在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激下，蛋白激酶被证明参与了昆虫头角角膜炎血细胞的信号转导(Charalambidisetal., 1995)。目前蛋白质激酶在昆虫免疫中的作用仍需进一步研究。

刺吸式昆虫在不同的发育阶段，其唾液成分也会发生改变来应对不同龄期的生理需要。如麦扁盾蝽Eurygasterintegriceps1龄若虫并不取食，因此其唾液中几乎不含有淀粉酶，当虫龄增长、取食增多时，其唾液中的淀粉酶活性也逐渐增强，在3龄期淀粉酶活性达到最强(Kazzazietal., 2005)。李皓(2019)对柑橘木虱Diaphorinacitri雌虫与雄虫唾液腺蛋白进行GO和KEGG功能分析发现柑橘木虱雌虫唾液腺在代谢途径、脂肪酸生物合成方面比雄虫唾液腺强。 唾液腺作为一种器官，本身含有的蛋白质种类十分丰富，既有组织蛋白，也有分泌蛋白(马琳, 2015)。刺吸式昆虫会根据不同的寄主植物和不同的生理需求，通过唾液组分的改变来达到取食和发育的目的(张燕, 2012)。白背飞虱不同虫态的唾液腺蛋白存在一定的差异，这可能与不同发育阶段和不同性别的取食行为有关。此外，白背飞虱唾液腺蛋白在信号转导机制方面表现活跃，若虫81个具有KOG功能注释的特有唾液腺蛋白中有22个参与信号转导机制，雄成虫64个具有KOG功能注释的特有唾液腺蛋白中有9个参与信号转导机制，雌成虫24个具有KOG功能注释的特有唾液腺蛋白中有3个参与信号转导机制，相关蛋白或许与取食为害行为存在一定的关系，但此方面还有待进一步的研究。本研究唾液腺蛋白的分类鉴定，可以为探究白背飞虱的刺吸危害提供参考，从而可以为白背飞虱的防控提供相关帮助。如通过干扰重要唾液腺蛋白的表达来抑制白背飞虱的取食或传毒。