靶向相变型载药纳米造影剂的制备及其基本性能和显像特性检测

刘建新 柳 阳 彭万宏

超声、CT、MRI、光声成像等各种医学影像技术在检查敏感性、分辨率等方面各具优缺点［1］。目前各种医学影像技术均有其各自的影像造影剂。尽管各种造影剂对疾病的诊疗发挥了一定的作用，但仍然不能突破单一影像技术的局限性。随着现代医学影像技术的不断发展，寻求多模态多功能影像造影剂从而实现多种医学影像技术的优势互补，提高影像诊疗的精准度，已成为现代医学的研究热点［2］。本实验以叶酸修饰的磷脂和胆固醇的混合物为成膜材料，将超顺磁性氧化铁（Fe3O4）纳米颗粒和羟基喜树碱（HCPT）装载于壳层中，液态氟碳全氟戊烷（PFP）包裹于壳层内，制备叶酸靶向相变型载羟基喜树碱的纳米粒（FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs），并检测其各种理化特性及其增强超声、光声、MRI 的显影能力，为后续的实验提供基础。

材料与方法

一、实验材料及仪器

1.主要试剂和细胞：氢化大豆卵磷脂、偶联叶酸的磷脂、二棕榈酰磷脂酰甘油（美国Avanti 公司），胆固醇［生工生物工程（上海）股份有限公司］，HCPT（远大医药黄石飞云制药有限公司），油酸氧化铁纳米颗粒（OA-Fe3O4，美国 Ocean Nano Tech 公司），PFP（美国Sigma 公司）；SKOV3 肿瘤细胞（重庆医科大学超声影像学研究所）

2.主要实验仪器：RE-5298旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），VX130 声振仪（美国Heat System 公司），5840R 低温离心机（湖南凯达科学仪器有限公司），IX53 光学显微镜（上海赛默飞世尔科技有限公司），S-3400N 电子显微镜（日立公司），低强度聚焦超声（LIFU）仪（重庆医科大学超声影像学研究所），MyLab 90 彩色多普勒超声诊断仪（意大利百胜医疗集团），Achieva 3.0T磁共振仪（荷兰Philips公司）。

二、纳米粒的制备

将氢化大豆卵磷脂、偶联叶酸的磷脂、二棕榈酰磷脂酰甘油、胆固醇及HCPT 以一定的质量比（10∶4∶3∶3∶2）称取后加入圆底烧瓶，同时加入OA-Fe3O4，用甲醇和三氯甲烷加热溶解。约20 min 后将上述圆底烧瓶固定于旋转蒸发仪上去除有机溶剂（时间120 min），然后加入PBS 洗脱水化，全程冰浴条件下逐滴加入液态氟碳PFP 200 μl，并使用声振仪乳化，得到均匀的乳白色混悬液。应用低温离心机在4℃条件下离心洗涤3 次，所得即为FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs，置于4℃冰箱保存备用。使用非偶联叶酸的磷脂替代偶联叶酸的磷脂即制备成非靶向纳米粒，不加入OA-Fe3O4则制备成不含Fe3O4的纳米粒。

三、纳米粒基本性能检测

1.基本性能检测：在光学显微镜及电子显微镜下观察纳米粒的形态。于不同时间点（制备后6、12、18、24、30、36、42、48 h）分别取样检测FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs的粒径。加入三氯甲烷和甲醇进行破球和溶解药物，离心分离取上清液，使用反相高效液相色谱法检测其内HCPT含量。

2.热致相变研究：取制备好的FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 乳液稀释100 倍后滴加于玻片上，并置于加热板内，调节温度分别为40℃、45℃、50℃和55℃，于光学显微镜下观察纳米粒的热致相变情况并记录。

四、体外寻靶实验及分组

将富含叶酸受体的SKOV3 肿瘤细胞种植在共聚焦专用培养皿内，与红色荧光染料DiI 标记的FAHCPT-Fe3O4-PFP NDs（靶向组）和不带叶酸的非靶向纳米粒（非靶向组）共孵育40 min，然后用PBS冲洗，加入多聚甲醛固定肿瘤细胞。随后依次加入荧光染料DiO 和DAPI，并避光送检。拮抗组采用游离叶酸与培养皿内SKOV3 细胞共孵育，然后加入荧光标记的FAHCPT-Fe3O4-PFP NDs，并依次进行固定、染色。于激光共聚焦显微镜下观察各组染色情况。

五、体外多模态显像增强实验及分组

1.增强超声成像：取2 ml FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 乳液置入凝胶模型，使用LIFU 仪探头对凝胶模型内乳液进行辐照。设置辐照参数：脉冲模式，辐照强度3.2 W/cm2，辐照时间1 min。然后取少许纳米粒乳液于光学显微镜下观察纳米粒粒径变化，了解其相变情况。最后使用彩色多普勒超声诊断仪（探头频率12 MHz，机械指数0.06）对凝胶模型内纳米粒乳液进行超声显像，使用灰阶模式和造影模式观察其在辐照前后超声显影情况，并应用重庆医科大学DFY 软件测量其声强。

2.增强光声成像：采用凝胶溶液稀释制备的FAHCPT-Fe3O4-PFP NDs 乳液，按最终混合液内Fe3O4浓度将其分为3组：0.5 mg/ml组、1.0 mg/ml组和2.0 mg/ml组，分别制作成凝胶块并标记，以不加纳米粒乳液的凝胶作为对照组，分别行光声成像并记录光声值。光声仪激光激发波长为680～950 nm，激发深度约1 cm。

3.增强MRI：取脱气水作为对照组Ⅰ（Ⅰ），不含纳米粒的1%凝胶作为对照组Ⅱ（Ⅱ）。将FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 乳液用1%凝胶稀释成不同的浓度作为实验组，记为：Ⅲ（5 μg/ml）、Ⅳ（10 μg/ml）、Ⅴ（20μg/ml）、Ⅵ（40μg/ml）、Ⅶ（80μg/ml）、Ⅷ（160μg/ml）、Ⅸ（320 μg/ml）、Ⅹ（640 μg/ml）、Ⅺ（1280 μg/ml）、Ⅻ（2560 μg/ml）。使用荷兰Philips 公司磁共振仪，采用T2 加权系列，设置扫描参数：TR 30.2 ms，TE 9.2 ms，flip 45°，FOV 160 mm，slice thickness 3.0 mm。测量每组磁共振信号强度，测量3次取平均值。

结 果

一、纳米粒基本性能检测

不含Fe3O4的纳米粒乳液外观呈乳白色，含Fe3O4的纳米粒乳液呈黑褐色（图1A）。光学显微镜下制备好的FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 呈球形，大小均一，分布均匀（图1B）；激光共聚焦显微镜下纳米粒呈球形或点状（图1C）。马尔文仪测得纳米粒平均粒径约（321.20±67.21）nm，电位约-50 mV。透射电镜显示Fe3O4颗粒在纳米粒内呈黑色小颗粒状（图1D），而不含Fe3O4颗粒的纳米粒内未见黑色小颗粒（图1E）。高效液相色谱法测得药物包封率和载药量分别为（60.51±2.33）%、（8.33±0.57）%。储存在4℃冰箱内的纳米粒在48 h 内呈现出良好的稳定性，其粒径大小变化见图1F。

二、纳米粒热致相变结果

在40℃时，无气泡产生；45℃时镜下可见气泡，已发生相变；50℃时，可见大量气泡产生；55℃时镜下仅可见少许残留大气泡。见图2。

三、体外寻靶实验结果

在激光共聚焦显微镜下，经荧光染料DAPI 染色后的细胞核呈蓝色荧光，经DiO 染色后的细胞膜呈绿色荧光，经DiI 染色后的纳米粒呈红色荧光。靶向组镜下可见较多红色荧光聚集在细胞膜周围，而在非靶向组和拮抗组的细胞膜周围未见明显红色荧光聚集。见图3。

四、体外多模态显像增强实验结果

图1 FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 基本性能检测

图2 不同温度下纳米粒的热致相变光学显微镜图

本实验使用不同浓度的纳米粒乳液进行体外光声及MRI。①纳米粒乳液经LIFU 辐照后，灰阶超声显示其回声增强，辐照前后声强分别为（12.2±2.8）dB、（136.5±5.7）dB，超声造影模式下显示其高增强；辐照前后声强分别为（6.7±2.3）dB、（86.3±5.2）dB；光镜下可见辐照后纳米粒体积增大，见图4。②随着浓度的增加，纳米粒体外增强光声成像的效果渐趋明显（图5），对照组、0.5 mg/ml组、1.0 mg/ml 组和 2.0 mg/ml 组所对应的光声值分别为0.21±0.09、0.58±0.06、1.41±0.12、2.13±0.11。③随着浓度的增加，纳米粒体外负性增强MRI的效果越明显，见图6。

图3 体外寻靶实验的激光共聚焦显微镜图

图4 纳米粒体外增强超声成像图

图5 不同浓度组纳米粒体外增强光声成像图

图6 纳米粒体外增强MRI图

讨 论

传统的影像学检查方式均有各自的优缺点［3］，融合多种成像模式的多功能造影剂的出现为现代分子影像学的发展指明了方向［4］，除显像功能外，其还能够在造影剂上装载药物，在影像监控下实现靶向治疗。在这一思路引导下，本实验拟制备集增强超声、光声、MRI及药物控释功能于一体的多模态多功能造影剂，并检测其理化特性，验证其增强多模态显像效能。

Shin 等［5］研究结果发现，虽然液态氟碳 PFP 沸点仅29℃，但经磷脂包裹成为纳米级颗粒后，由于纳米粒周围的Laplace 压力明显增加，PFP 的气化阈值随之升高。本实验结果发现，在40°C 时纳米粒基本不发生相变，当温度逐渐升高至50°C 时，纳米粒相变最显著，镜下见相变后产生大量气泡，这说明PFP 纳米粒既能保持一定的稳定性，也能在一定条件下继发相变。同时本实验也发现制备的FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 在4℃条件下可稳定保存48 h 而不发生明显相变。反相高效液相色谱法测得的HCPT 载药量（8.33±0.57）%，包封率（60.51±2.33）%，较高的包封率和载药量为后续的治疗研究提供了保障。

本实验使用的磷脂成分与生物有机体细胞膜的磷脂成分相同，安全性高；液态氟碳具备较好的携氧能力，可被用作血液替代品［6］，同时其还能够溶解于血液中并通过呼气排出体外［7］；Fe3O4在体内可被红细胞代谢，再进入正常血浆铁池，参与到机体的代谢过程，具备良好的生物安全性［8］。叶酸性质稳定，分子量小，且无免疫原性［9］，较多恶性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌等组织中叶酸受体均呈高表达，而在正常组织中叶酸受体不表达［10］。在体外寻靶实验中，靶向组在SKOV3肿瘤细胞周围及内部见较多纳米粒聚集，而非靶向组SKOV3 肿瘤细胞周围及内部无纳米粒聚集，说明叶酸具备的高效靶向性有连接其受体的能力；拮抗组在加入游离叶酸后，阻断了后续加入的靶向纳米粒与肿瘤细胞的特异性结合，也从侧面说明了叶酸与肿瘤细胞结合的高效特异性。

体外多模态显像增强实验结果表明，FA-HCPTFe3O4-PFP NDs 可以明显增强超声、光声及MRI 显影能力。液态氟碳PFP具备良好的热致相变及声致相变的特性，超声波被认为是最有效的继发相变的方式，本研究中使用LIFU仪辐照制备的纳米粒乳液，使得纳米粒发生声致相变，从而明显增强超声成像效果。引入Fe3O4后，纳米粒具备增强光声成像的作用，且随着纳米粒浓度的增加，光声信号明显增强，光声值亦明显升高。作为一种负性增强对比剂，Fe3O4使得纳米粒的MRI T2 信号强度降低，且浓度越高其信号强度越低，与对照组的高信号呈明显差异。

综上所述，本实验制备的FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 同时装载了PFP 和Fe3O4，有望实现多模态显像；引入HCPT，使其在多模态显像的同时，能够达到药物治疗的目的；在纳米粒表面修饰叶酸受体后，纳米粒能够特异性的靶向结合于高表达叶酸受体的肿瘤细胞周围，进行局部精准显像和靶向治疗，使得FAHCPT-Fe3O4-PFP NDs有望成为极具潜力的分子探针。