SDC2基因甲基化对结直肠癌诊断价值的Meta分析

王 倩， 商 建， 王晓月， 李自昂， 程 洁， 林 军

武汉大学中南医院消化内科，湖北 武汉 430071

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)发病率、致死率分别居全球恶性肿瘤第三、二位，在我国均居第五位[1-2]。病理活检是确诊CRC的金标准，但存在肠道清洁过程复杂、肠镜检查依从性差等问题。血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖类抗原199(carbohydrate antigen 199，CA199)、粪便潜血(fecal occult blood test，FOBT)等检测CRC灵敏度(sensitivity,Sen)及特异度(specificity,Spe)不理想[3]。表观遗传学研究表明，CRC基因甲基化主要位于启动子区域的CpG岛，该过程发生较早且稳定，对于肠道肿瘤具有极高的诊断价值[4-6]。多配体蛋白聚糖2(Syndecan-2，SDC2)是一种位于细胞表面的跨膜蛋白聚糖，可通过MAPK途径和上皮-间质转化产生致癌作用[7-8]。研究发现，SDC2在胃癌[9]、头颈部鳞状细胞癌[10]等多种肿瘤中呈现高度甲基化。SDC2在CRC中也呈高度甲基化，但各研究SDC2基因甲基化诊断效能差异明显[11-13]。本研究拟通过Meta分析探究SDC2甲基化在CRC中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 文献检索文献检索由两名评价人员独立进行。计算机检索PubMed、Embase、Cochran Library、Web of Science、维普中文科技期刊数据库(VIP)、中国学术期刊全文数据库(CNKI)、万方数据库(WanFang)、中国生物医学文献数据库(CBM)公开发表的SDC2基因异常甲基化与CRC的关联文献。检索时间为各数据库建库开始至2020年9月1日，其中以“结直肠癌、结直肠肿瘤、大肠癌、大肠肿瘤、SDC2、Syndecan-2、Syndecan 2、多配体蛋白聚糖2、黏结合蛋白多糖2、黏结合蛋白聚糖2、甲基化、DNA甲基化”为关键词检索中文数据库；以“colorectal neoplasms*、colorectal cancer*、colorectal tumor*、colorectal carcinoma*、SDC2、Syndecan-2、heparan sulfate proteoglycan core protein、methylation*、DNA methylation*、epigenomic*”等为关键词检索英文数据库。

1.2 文献纳入标准(1)英文、中文的病例对照或横断面研究；(2)关于定量甲基化特异性PCR(quantitative methylation specific PCR，qMSP)检测SDC2基因甲基化的文献；(3)病理和(或)肠镜为诊断金标准，确诊CRC或健康正常对照；(4)文献数据完整，可构建2×2诊断四格表，即真阳性(true positive，TP)、真阴性(true negative，TN)、假阳性(false positive，FP)、假阴性(false negative，FN)。

1.3 文献排除标准(1)无病理作为CRC诊断依据；(2)检测SDC2基因甲基化方法不清楚；(3)综述、会议论文、动物细胞机制实验、案例报道等文献；(4)资料不完整、无法构建2×2四格表的文献；(5)同一团队的重复数据。

1.4 文献数据提取2名研究者独立提取内容信息后核查对方提取信息。如果意见不一致，则商讨解决。提取内容为第一作者、发表年份、国家、样本类型、检测方法、检测基因、样本量、TP、FP、TN、FN等。

1.5 文献质量评价2名研究人员依据诊断准确度质量评价(quality assessment of diagnosis accuracy studies，QUADAS-2)标准[14]单独评价文献质量。该标准共14个问题，每一个项目可被评为“是”即1分，“不清楚”、“否”评为0分。如研究人员意见不一致，则商讨解决。

1.6 统计学分析使用Stata 12和MetaDisc 1.4统计分析，Revman 5.3软件制作文献质量评价图。Spearman相关系数用以检验阈值效应，若P<0.05则有阈值效应，反之无阈值效应。Cochran-Q检验及I2评估研究异质性，若P<0.10，I2>50%，提示异质性大，采用随机效应模型；反之异质性小，则采用固定效应模型。采用双变量荟萃分析模型计算合并的Sen、Spe、阳性似然比(positive likelihood ratio，PLR)、阴性似然比(negative likelihood ratio，NLR)、诊断比值比(diagnostic odds ratio，DOR)，绘制综合受试者工作特征曲线(summary receiver operating characteristic curve，SROC)及曲线下面积(area under curve，AUC)、似然比点图和Fagan图；采用敏感性分析、亚组分析明确异质性来源。Deek’s漏斗图用以评价纳入文献偏倚大小，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 文献筛选过程计算机共检索260篇文献，其中外文数据库90篇，中文数据库170篇，去除重复文献后保留183篇原始文献。经阅读文献标题、摘要后，分别排除与SDC2基因及CRC无关文献123篇、综述、系统评价或个案报道等文献22篇。共38篇文献全文阅读，分别排除细胞动物或机制研究5篇，实验数据重复3篇，数据不全或无法提取14篇，甲基化检测方法非qMSP或不清楚4篇，非英文或中文1篇，最终符合标准的11篇文献[15-25]纳入系统评价，包括9篇英文文献、2篇中文文献，均为CRC样本(n=1 419)与健康对照样本(n=1 363)SDC2甲基化对照研究。文献筛选流程及结果见图1，纳入研究的基本情况见表1。

图1 纳入文献筛选流程图 Fig 1 Flow chart of included literature screening

表1 纳入文献的基本信息及方法学质量评价Tab 1 Basic information and methodological quality evaluation of the studies included in the Meta-analysis

2.2 纳入文献的质量评估本研究最终纳入11篇文献，其中10篇研究采用qMSP，1篇采用LTE-qMSP。所有研究均以病理和(或)肠镜作为诊断金标准。运用QUADAS-2质量评价工具共14个条目对纳入文献进行质量评估，质量评分均≥4分，表明文献质量良好。病例选择维度(4/11)为高风险，主要原因是纳入研究为病例对照研究设计或未阐述病例是否连续纳入。待测方法维度(2/11)为高风险，主要原因为部分文献未阐述是否提前设置阈值。金标准维度(7/11)为低风险，表明大多数文献的金标准合理。病例流程及进展维度(9/11)为不清楚风险，主要原因是由于CRC以病理和(或)肠镜为金标准，但对照组一般不行病理检查。适应性方面所有文献均为低风险，提示纳入文献适应性良好。QUADAS-2得分情况结果见表1，各维度评分见图2。

注：A:质量评价结果条例图;B:质量评价结果总结图。

2.3 异质性分析采用MetaDisc 1.4检验阈值效应，Spearman相关系数为-0.145，P=0.670，表明本研究无显著阈值效应。采用Cochran-Q检验非阈值效应，Q=339.60，P=0.000，I2=97.06%，说明本研究主要存在非阈值效应引起的异质性，由于异质性较大，选用随机效应模型合并效应量。

2.4 合并效应量本Meta分析共纳入1 419例CRC患者和1 363名健康对照者，Sen合并=0.77(95%CI：0.65～0.86)，Spe合并=0.95(95%CI：0.92～0.96)，PLR合并=14.17(95%CI：9.14～21.99)，NLR合并=0.24(95%CI：0.16～0.38)，DOR合并=58.28(95%CI：28.25～120.20)，AUC=0.95(95%CI：0.93～0.97)。Fagan图提示，SDC2检测阳性，则患CRC几率达80%；SDC2检测结果阴性，则患CRC几率下降至6%。似然比点图提示大多数文献(7/11)有确诊价值(见图3～4)。

注: A：Sen合并图; B：Spe合并图; C：PLR合并图;D：NLR合并图;E：DOR合并图; F:SROC曲线图。

图4 纳入文献Fagan图(A)和似然比点图(B) Fig 4 Fagan diagram (A) and likelihood ratio point diagram (B) of included literature

2.5 亚组分析按照样本类型分类，分为粪便组、血液组、组织或肠道灌洗液组，其Sen合并分别为0.83(95%CI：0.80～0.85)、0.58(95%CI：0.54～0.62)、0.84(95%CI：0.77～0.89)；Spe合并分别为0.94(95%CI：0.92～0.96)、0.94(95%CI：0.92～0.96)、0.91(95%CI：0.86～0.95)；DOR合并分别为84.23(95%CI：55.72～127.35)、33.27(95%CI：8.05～137.56)、54.20(95%CI：24.70～118.91)；AUC分别为0.95、0.98、0.84。由此可见，粪便样本SDC2甲基化诊断CRC价值显著高于血液及其他样本类型。

根据地区分组，分为亚洲地区、非亚洲地区，其Sen合并分别为0.82(95%CI：0.79～0.84)、0.40(95%CI：0.35～0.46)；Spe合并分别为0.94(95%CI：0.93～0.95)、0.92(95%CI：0.87～0.96)；DOR合并分别为76.44(95%CI：56.03～104.30)、16.50(95%CI：2.97～91.52)；AUC分别为0.95、0.97。由此可见，亚洲地区SDC2甲基化诊断CRC价值显著高于非亚洲地区(见表2)。

表2 SDC2甲基化对CRC诊断效能的亚组分析Tab 2 Subgroup analysis of diagnostic performance of SDC2 methylation for CRC

2.6 敏感性分析敏感性分析结果显示，依次剔除单个研究后，合并效应量无差异，提示纳入研究稳定性较好，本研究分析结果稳定可靠(见图5)。

图5 纳入研究的敏感性分析 Fig 5 Sensitivity analysis of the included literature

2.7 发表偏倚Deek’s漏斗图结果显示，t=-0.21，P=0.840，表明该研究不存在显著发表偏倚(见图6)。

图6 Deek’s 漏斗图检测发表偏倚 Fig 6 Publication bias detected by the Deek’s funnel plot

3 讨论

CRC发病率逐年升高，严重危害人类健康。CRC发生转移时5年生存率显著下降，因而筛查CRC尤为重要[26]。目前筛查CRC工具主要包括结肠镜、粪便潜血检测等。然而，肠道准备复杂、侵入性强等原因导致国人对结肠镜检查依从性不高，粪便潜血较高漏诊率和误诊率也限制其在CRC中的筛查作用。DNA甲基化是指S-腺苷甲硫氨酸的甲基在酶作用下添加到DNA分子的碱基上，该过程在基因启动子区CpG岛高发，被认为是导致CRC的第3个机制[27-29]。甲基化检测位置较基因突变更稳定，并且该过程贯穿于结肠息肉发展到CRC的整个过程，有利于CRC筛查[30-31]。外周血SEPT9诊断CRC的总体Sen为64%～69%，Spe为90%～91%[32]。NEUROGl诊断CRC的Sen为61%，Spe为91%[33]。现有甲基化标志物对CRC诊断价值不高，迫切需要研发新的标志物用于早期诊断CRC。

SDC2在CRC中扮演重要角色，通过调节细胞与微环境的相互作用，促使基质金属蛋白酶活化分解细胞外基质；参与间质-上皮转化过程；促进血管合成等过程，加速肿瘤细胞生长及扩散转移[7，34-35]。邓通明等[36]研究表明，粪便SDC2基因甲基化区分CRC及非CRC高危人群的Sen为86.67%，Spe为95%以上。Oh等[37]研究表明，粪便SDC2甲基化诊断CRC的Sen、Spe均为90%以上；SDC2甲基化在CRC组织中阳性率为100%，在正常健康组织中为0。以上研究表明，SDC2甲基化在CRC中具有较高的诊断价值，但有关SDC2甲基化在CRC诊断价值的Meta分析鲜有报道。因此，本研究首次采用Meta分析方法汇总国内外文献，评价SDC2甲基化在CRC中的诊断价值。

本研究共纳入2篇中文文献和9篇英文文献，共1 419例CRC患者和1 363名健康对照者。本研究存在一定异质性，故选用随机效应模型合并效应量。Meta分析结果显示，Sen合并为77%，Spe合并为95%，漏诊率和误诊率分别为23%和5%，表明SDC2作为CRC筛选指标有较低漏诊率及误诊率，与Chen等[38]研究结果一致。通常PLR>10，NLR<0.1，表明待测方法具有非常高的诊断价值，当PLR>5，NLR<0.2时，显示待测方法具有一定诊断价值，本研究PLR合并为14.17，提示当SDC2检测为阳性时，CRC样本是健康样本的14.17倍，NLR合并为0.24，提示当SDC2检测阴性时，CRC样本是健康样本的0.24倍，表明SDC2具有较高的诊断效能。通常DOR>1提示待测方法具有诊断价值，值越大诊断价值越高，本研究DOR合并为58.28，表明SDC2检测CRC真阳性率是假阳性率的58.28倍，提示SDC2甲基化对于CRC有非常高的诊断价值。本研究AUC为0.95，表明SDC2甲基化能正确区分CRC及健康样本的几率为95%。通常AUC>0.9提示待测方法具有极好的准确性，因此，通过上述研究结果表明，SDC2甲基化检测对诊断CRC具有较高的诊断效能。

异质性分析是Meta分析的重要部分，Spearman相关系数结果表明本研究无显著阈值效应，Cochran-Q检验及I2提示本研究存在由非阈值效应引起的异质性。亚组分析结果显示，不同样本类型及不同地区能显著影响SDC2基因甲基化诊断CRC的效能，可能是导致本研究异质性较高的原因。本研究粪便样本Sen合并为83%，Spe合并为94%，且粪便DOR为84.23，显著高于血液(DOR=33.27)及肠灌洗液或组织(DOR=54.20)，提示粪便样本SDC2甲基化对于CRC诊断价值极高。李创坤等[39]研究表明，粪便SDC2诊断CRC的Sen约85%，与本文研究结果一致。但血液来源的5个研究DOR合并的I2高达89.0%，其他样本来源DOR合并的I2分别为3.5%和0，提示血液样本SDC2基因甲基化诊断CRC的稳定性较差，可能与血液DNA容易降解、检测技术难度大等原因有关。根据不同地区亚组分析结果表明，亚洲地区SDC2甲基化诊断CRC的Sen合并为82%，Spe合并为94%，且DOR合并为76.44，显著高于非亚洲地区(DOR=16.50)，提示在亚洲地区人群中SDC2甲基化诊断CRC价值极高。非亚洲地区3个研究DOR合并的I2高达82.9%，亚洲地区研究DOR合并的I2为0，提示SDC2基因甲基化诊断非亚洲地区人群CRC的稳定性较差，可能与非亚洲地区人群(覆盖欧洲、澳洲)种族差异有关。此外，SDC2基因甲基化检测方法qMSP类别差异(如SYBR Green法或Taqman探针方法)，样本采集方式、保存条件、截断值及病理特征等差异可能是导致本研究异质性较大的原因，但由于部分文献未报道相关信息，无法进行亚组分析明确异质性来源。依次剔除每篇文献，得到不同的合并效应量，结果无显著差异，表明分析结果稳定可靠。漏斗图分析提示本文无显著发表偏倚，文献质量评价结果显示纳入研究质量较优异，因此本Meta分析结果可靠。

本Meta分析存在一定的局限性：(1)本研究只纳入2篇中文文献和9篇英文文献，可能导致无其他语种文献的语种偏倚；(2)因为具有统计学意义的成果常比无统计学意义的成果更易发表，因而阳性成果与阴性成果获取几率不同，可能存在发表偏倚；(3)本文研究异质性较高，根据样本类型、地区进行亚组分析后各组样本量减少，需要进一步扩大每组样本量以提高合并效应准确性；(4)本研究排除无法提取健康样本甲基化情况的研究，无法明确SDC2基因甲基化鉴别CRC与其他易混淆疾病的Sen、Spe等情况；(5)亚组分析时，组织及肠灌洗液文献较少，无法单独合并提取效应量，亚组分类不够理想；(6)本研究排除qMSP外检测SDC2基因甲基化方法的研究，如焦磷酸测序及非定量MSP等，导致研究样本量减少，从而降低研究的可靠性。

综上所述，SDC2基因甲基化诊断CRC价值极高，尤其是粪便SDC2基因甲基化可作为一项新的生物标志物用于亚洲人群CRC筛查，但仍需要大量高质量的研究进一步验证。