Hippo-YAP信号通路与LGR5+肠道干细胞相关研究

郑美佳， 贾 瑞， 魏海梁， 闫曙光， 李京涛

1.陕西中医药大学基础医学院胃肠病教研室，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学附属医院普外科；3.陕西中医药大学附属医院感染科

肠道上皮组织为单层柱状细胞，具有吸收、屏障以及内分泌的功能，位于隐窝基底部的LGR5+ISC是肠上皮更新的源泉，同时肠道损伤后上皮再生的过程也源于LGR5+ISC。Hippo信号通路是决定LGR5+ISC命运的关键控制开关之一，其关键激酶YAP在维持肠道稳态、介导损伤后的上皮修复等方面发挥重要作用，并且YAP参与调控LGR5+ISC增殖分化失衡所导致的多种肠道疾病过程，本文就Hippo-YAP调控LGR5+ISC、LGR5+CSC在肠上皮再生、肿瘤相关的研究进展和前景作一概述。

1 LGR5+肠干细胞简介

富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5(leucine-richrepeat-containing G protein-coupled receptor 5，LGR5)是一种公认的干细胞标志物，同时在癌干细胞(cancer stem cells，CSC)中也表达LGR5，并显示广泛的干细胞样多能和自我更新的特性。2007年其中一类LGR5基因表达阳性的隐窝基底柱状细胞(crypt-base columnar cell，CBC)在隐窝基底部Paneth细胞之间的+1～+3位置被发现，这类细胞具有高增殖和辐射敏感的特性，同时具有高度可塑性和产生多谱系分化的子代细胞及长期的自我更新的特点，被认为是真正的ISC[1-3]。实验研究表明，从肠道中分离出的单个LGR5+ISC足以形成肠内小体，即一个三维培养系统，并且能产生所有上皮细胞类型，补充肠道整个隐窝—绒毛轴，对整个肠道的稳定更新起着非常重要的作用，当LGR5+ISC功能失衡可能诱发炎症性肠病、肠道肿瘤、息肉、腺瘤、肠癌、短肠综合征等肠道相关疾病[4-5]。除此之外在特定情况下，包括Paneth细胞、肠内分泌细胞等在内的一些终末分化细胞也具有一定程度的可塑性，这些细胞也可以重新进入生态位，去分化转变成LGR5+ISC补充其数量，满足干细胞增殖要求[6]。

2 Hippo-YAP信号通路调控LGR5+ISC增殖分化

Hippo-YAP通路又称河马通路主要由上游调节因子MST1/MST2、核心因子LATS1/LATS2、下游效应因子YAP/TAZ这3部分组成，与其他通路不同，这条通路还无特异性受体和相关配体。Hippo信号通路的核心是一条激酶链，受上游G蛋白偶联受体信号传导或酪氨酸激酶活化等信号调控MST的活性，进而磷酸化LATS，导致YAP和TAZ在细胞质中失活降解；当MST和LATS去磷酸化后，YAP和TAZ恢复转录活性，在细胞核中积累，并通过与转录因子如TEAD结合的方式调节促进细胞增殖、细胞存活的靶基因的表达。河马通路的关键激酶—YAP(Yes-associated protein)常作为再生和原癌基因在肠干细胞稳态调节的过程中发挥着重要作用，YAP活性不仅受上游信号因子及其他信号通路串扰调控，对邻近细胞及ECM的机械信号也很敏感[7-8]。在稳定状态下，河马通路不断抑制YAP信号以维持隐窝-绒毛的完整性，在内源性和外源性损伤情况下，河马通路可以激活YAP信号传导并参与LGR5+ISC增殖分化再生肠上皮细胞修复肠道损伤的程序[9]。

3 YAP参与LGR5+ISC调控肠上皮细胞更新维持ISC稳态修复肠道损伤的程序

Liu等[9]已报道，YAP在肠黏膜愈合过程中起着重要作用，并被建议重塑干细胞。YAP依赖于不同信号通路相互作用，参与LGR5+ISC增殖分化凋亡的过程。其中，YAP可以促进细胞存活并诱导EGFR通路激活，暂时重新编程LGR5+ISC来实现肠道再生程序，并且YAP活化导致LGR5+ISC自我更新潜能的增加[10-11]。在Notch信号通路中，成熟的Paneth细胞在辐照后会重新进入细胞周期，活跃地分裂，并重新分化为其他细胞类型，这些受辐照的Paneth细胞失去了典型的Paneth细胞标记，并获得了与ISC相关的基因标记，并且从辐照小鼠中分离出的Paneth细胞可以生成LGR5+ISC，而YAP的核易位先于该过程，这意味着它参与了依赖于Notch信号通路的Paneth细胞重编程再生LGR5+ISC的过程[12]。除此之外，Ayyaz等在《Nature》杂志2019年5月发表的一篇文章中又发现肠道一类特殊的干细胞—复活干细胞(revival stem cell，revSC)，revSC可以产生所有细胞层次的肠道细胞，包括LGR5+ISC，这种独特的干细胞在稳态条件下非常少见，但在辐射损伤、针对性去除LGR5+ISC或用DSS处理肠道组织后，revSC在肠损伤状态下瞬间扩增后同时经历一种YAP依赖性的短暂增殖，从而被调动恢复静态的干细胞池[1]。

但这种状态并不是一直持续的。Gregorieff等[11]研究继续发现，在肠道损伤前期，YAP可以短暂激活，但持续的YAP活性可以清除ISC细胞，以至于不会出现持续增殖，从而不会引起肠道异常增生性疾病的发生发展。Cheung等[13]也在实验中发现，敲除大鼠LAST1/2或激活YAP而诱导的细胞状态可能代表了暂时修复的细胞状态，他们检查了YAP形成细胞类器官的能力，产生了一个结肠细胞器，允许诱导表达YAPS127A，发现强力霉素诱导48 h YAP表达会使细胞器失去单细胞柱状组织，阻止它们继续生长，4-OHT治疗的大鼠LATS1/2cKO结肠也表现出类似的无法生长或形成三维结构的表型，并且在腹腔注射他莫昔芬和多西环素诱导的基因敲除小鼠中发现YAP激活的ISC在10 d内被赶出肠隐窝和绒毛，LGR5-CreERT2 Lats1fl/flLats2fl/flRosa26mT/mG小鼠的谱系追踪同样显示在他莫昔芬诱导后2周和1个月，GFP+ISC逐渐丢失，YAP通过TEAD依赖的转录活性导致干细胞特性丧失，并且可以在Wnt信号存在的情况下LGR5+抑制Wnt和结肠干细胞程序。另外，Li等[14]研究发现，LATS1/2缺失会导致LGR5+ISC丢失，并且产生严重的肠道生长和分化缺陷，导致大鼠在产后第10天时死亡，LGR5+ISC丢失很可能是由Wnt通路抑制引起的，但单独去除大鼠LATS1、LATS2在3个月时无明显的表型，RNAscope分析还显示，在LATS1/2突变的肠道中，Axin2和LGR5转录几乎完全丢失，表明LATS1/2激酶是维持隐窝Wnt通路激活所必需的。一直以来YAP/TAZ均被认为充当Wnt信号传导的抑制剂，对Wnt信号传导的作用似乎是抑制性的。Ayyaz等[1]、Gregorieff等[10]、Yui等[15]利用scRNA-seq阐明了YAP在将结肠细胞重新编程为高Klf6表达的细胞类型中的作用，该表达是修复上皮所特有的，与稳态过程中存在的所有细胞类型不同，这种状态的特征是损伤相关基因的表达和低Wnt信号，这证实了早期发现YAP抑制肠道Wnt信号及LGR5和Axin2表达的理论[13]。

4 YAP即可作为致癌因子也可作为肿瘤抑制因子参与LGR5+CSC调控

成人ISC的可塑性和长寿命被认为它们更易受到致癌转化的影响，从而成为癌症的起源，因此已有研究证明，人类LGR5+ISC在生长的癌症组织中充当CSC[16]。CSC的存在一直被认为是肿瘤发生发展、转移、耐药的根本原因，而正常组织中的LGR5+ISC已被证明是体内致癌突变后肠腺瘤、结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的起源细胞，并且在CRC肿瘤启动、进展和转移中，小肿瘤群体LGR5+CSC可以通过促进肿瘤生长和转移来驱动癌症的启动和/或进展[17-19]。TAZ的mRNA水平常作为大肠癌预后的指标，YAP可以增加体外癌症干细胞的数量，基因敲除YAP/TAZ表达可以减少癌细胞迁移、侵袭和肿瘤形成[23]。实验研究证明，YAPWT小鼠在化学诱发的癌细胞瘤中更易患结肠炎相关癌症(colitis associated carcinoma，CAC)，YAP可以直接与细胞核中的β-catenin相互作用，并形成YAP/β-catenin/TCF4复合体，而LGR5和Cyclin D1被确认为该复合物的目标基因[20]。

尽管YAP在许多组织中被认为是致癌的，但YAP在CRC中的作用仍然具有争议性，Cheung等[13]研究结果确立了YAP在成年结肠中作为肿瘤抑制因子的作用，他们在NSG小鼠的结肠中注射AKP细胞器，并在注射后2周在小鼠饮用水中加入多西环素诱导YAP5SA表达，组织学分析表明，肿瘤细胞在多环素4 d后呈现不同的形态，细胞质增大，柱状形状丢失，并且LGR5的表达完全丧失，而这些表达YAP的细胞也不是增殖的。不仅如此，YAP5SA表达会导致患者衍生的CRC有机蛋白线的生长减少，并伴随着YAP靶点表达的增加及ISC和Wnt标志物LGR5和Axin2的强烈下调。Cheung等[13]又观察了肿瘤启动能力和转移潜力，在6周肿瘤生长的小鼠中用强力霉素诱导YAP表达2 d，并通过FACS分离EpCAM+细胞，2 d后实验结果表明细胞核的YAP及其靶点AmotL2增加，ISC和Wnt标记LGR5和Axin2减少，并且YAP的激活对已建立的转移性肿瘤的形态有显著影响，并伴有明显且大面积的坏死，另外，家族性腺瘤性息肉(FAP)和结肠肿瘤生长均需要YAP，在Apcfl/fl和Apcfl/flYapfl/flTazfl/fl小鼠结肠黏膜中注射表达CRE重组酶的腺病毒，尽管注射后8周的所有小鼠均出现肿瘤，但这些小鼠的肿瘤负荷均有所增加，最后他们实验证实了YAP/TAZ在APC突变结肠肿瘤中是一种真正的肿瘤抑制因子，而且在这种细胞背景下，YAP激活作为一种可行的治疗策略。Moya等[21]也发现YAP/TAZ的抑癌作用，他们发现野生型肝脏中生长的肿瘤细胞需要YAP和TAZ才能生存，而那些被YAP和TAZ缺乏的肝细胞包围的肿瘤细胞并不依赖于YAP和TAZ，他们发现YAP和TAZ是通过细胞竞争机制来消除肿瘤细胞，通过将CRE表达的腺相关病毒8(AAV-Cre)注射到Yapfl/fl；Tazfl/fl小鼠中获得N-Akt肿瘤，肿瘤负担的增加是由于肿瘤细胞增殖的增加，从Ki67阳性肿瘤细胞数量的增加就可以证明，这些数据突出了YAP/TAZ在瘤周肝细胞中的一种意想不到的活性，这种活性非自发地抑制了肿瘤的生长，并且肿瘤周围肝细胞的异位YAP激活足以诱导肿瘤消退，可能是由于触发肿瘤细胞的非凋亡程序性细胞死亡，这是由BCL2过表达所导致的。除此之外，在另外一项实验研究中，乳腺癌细胞中同样基因敲除YAP基因能够抑制细胞凋亡和迁移，提高细胞的侵袭能力、促进肿瘤生长[22]。这些实验结果证明了YAP既可以作为肿瘤启动子存在，又可以作为肿瘤抑制因子存在而发挥双重作用，出现这种结果的原因，一方面YAP在存在多重致癌突变的情况下拮抗僵硬并抑制Wnt，使小鼠与原发性和转移性CRC模型的LGR5+CBC不增殖并诱导肿瘤回归；另一方面，某些CRC细胞的生长需要YAP，这一结论支持YAP作为结肠内癌基因的观点，然而，YAP的依赖性可能是体外培养的一个特征，并不反映体内的生理要求。如YAP的缺失对正常肠道而言未影响体内稳态，肠道器官的体外生长依赖于YAP，这些结果可能反映YAP在有丝分裂重组中的作用，而不是肿瘤生长本身的作用。此外，这些实验是在发育性YAP缺失的背景下进行的，并且可能不能说明在成人突变中将会发生的事情。因此，使用急性、成人和结肠特异性的YAP操作，代表了研究YAP在腺瘤生长中作用的最相关模型。此外，Cheung等[13]通过实验发现，诱变剂的作用出现散发性结肠肿瘤不需要YAP，排除了YAP在肿瘤起始中的作用。

LGR5+CSC具有高度可塑性和表型异质性的特点[16]。一直以来，LGR5+CSC均被认为是肿瘤转移性疾病的种子，但最近的研究表明，大多数的CRC转移灶为LGR5-癌细胞。Fumagalli等选择白喉毒素(DT)对LGR5+CSC进行选择性消融，他从原发性肿瘤1 000多个迁移细胞中发现其中大多数是LGR5-癌细胞，也就是说CRC转移灶大多数是由LGR5-细胞开始传播的[24]。有研究[12, 25-26]也证明，消融小鼠CRC中LGR5+CSC可抑制原发性肿瘤的生长但不会消退，消融CRC中LGR5+CSC会引起其他已分化肿瘤细胞的代偿增殖，去分化恢复干细胞表型，此时肿瘤是由LGR5-细胞来维持，而这一切可能与LGR5-癌细胞的可塑性及YAP促进细胞去分化调节作用有关，而且这种可塑性可以通过HGF和FGF等微环境因素进一步增强，并为驱动癌细胞转移做好准备。YAP/TAZ除了具有促进癌细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进细胞去分化的作用，在基因组稳定性、代谢重编程、肿瘤免疫等方面还发挥着重要作用。在肿瘤形成机制中，研究发现，YAP可以促进细胞对葡萄糖等营养物质吸收、分解、代谢，从而满足癌细胞快速生长和增殖对于ATP等能量的需求，并且YAP激活可以促进基因组不稳定性从而推动肿瘤发生发展[26-27]。除此之外，慢性炎症的反复刺激易引起YAP过度激活，YAP活化诱发骨髓源抑制细胞(MDSCs)和肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的两极分化和募集及炎症因子的分泌在肿瘤起始和发展中的机制也非常重要[28-29]。Zhou等[30]通过特异性敲除YAP的实验发现，YAP可以通过调控巨噬细胞极化，抑制M2型巨噬细胞极化，促进巨噬细胞向M1型极化及产生促炎炎症因子IL-6，YAP cKO小鼠也能促进肠道部位抗菌肽的产生进而导致肠道菌群稳态失衡，加重炎症性肠病。这与前面的研究有所不同，表明YAP在不同类型细胞中的多种功能是值得注意的。另外，由于YAP活性的精确调控存在难度，评价YAP/TAZ能否以安全的方式得到利用一直是科学家目前想要解决的难题，而相应的就要发挥YAP在肠道再生与肿瘤之间的药物调控潜力[10]。

5 临床价值与治疗前景

目前正在探索几个创新方案，以治疗性地针对CSC，包括抗体-药物结合，针对静默的CSC，并抑制CSC相关的途径。然而正如前面总结的，不同的机制可能导致治疗阻力，因此，在这方面可能需要联合疗法。Hippo-YAP信号通路已成为靶向、化疗和潜在免疫治疗耐药性的关键，YAP和TAZ也被认为是癌症治疗的有吸引力的靶点。研究者们已进行了多种尝试来评估Hippo-YAP调节药物在这些情况下的治疗潜力，如以小分子靶向Hippo途径刺激YAP的核积累来促进肠道修复，Huang等[39]发现，靶向内皮细胞Gasdermin D诱导线粒体DNA(mtDNA)释放到内皮细胞胞浆中，通过DNA传感器cGAS识别mtDNA，生成第二信使cGAMP激活的cGAS-YAP信号通路可作为炎症损伤后内皮功能恢复的潜在策略。亦或是寻找一种够将YAP和TAZ封存在细胞质中的化合物如他汀类药物，他汀类药物能够将YAP和TAZ封存在细胞质中，并且效果最显著，大量证据表明他汀类药物具有肿瘤抑制作用，但临床研究表明这类药物不适合作为抑制剂使用[31, 40]。Chen等[32]实验研究发现，miR-375在各种癌症中充当肿瘤抑制剂，YAP是miR-375的功能目标基因，而miR-375又作为METTL14的下游目标，并且两者呈正相关，MELLT14在CRC细胞核组织中表达量低，在正常细胞组织中表达量高，敲低MELLT14后m6A的水平明显降低，提示两者也呈正相关，上调MELLT14后可抑制CCK-8和EdU检测中CRC细胞增殖，在迁移和侵袭实验中进一步发现上调的METTL14抑制了CRC细胞迁移、侵袭，并且以依赖m6A的方式通过miR-375/YAP1和miR-375/SP1通路抑制了CRC细胞生长。Mohamed等[29]研究发现，miR-363通过直接针对LATS2 mRNA产生抗药性，进而激活YAP。然而由于越来越多的文献涉及YAP/TAZ激活对靶向疗法、化疗、放疗及潜在的免疫疗法的抵抗力，升高的YAP/TAZ水平有助于抵抗化疗及对靶向治疗的获得性耐药性，而抑制YAP/TEAD和针对这些途径的靶向治疗的组合方案将可能克服内在和后天的耐药性。VGLL就是一种广为人知的YAP/TEAD相互作用抑制剂，VGLL可以抑制胃癌细胞系的癌干细胞相关特性，并抑制异种移植模型中的肿瘤生长[33]。Verteporfin(VP)是黄斑变性影射治疗中的临床光敏剂，它也可以消除YAP/TEAD的相互作用。Vigneswaran等[34]研究发现，YAP/TAZ-TEAD可以直接调节SOX2、C-MYC和EGFR本身的转录，以创建一个向前反馈循环并推动人类胶质母细胞瘤(GBM)细胞的生存和增殖，而VP是YAP/TAZ-TEAD介导转录的干扰剂，可以诱导EGFR放大/突变GBM细胞的凋亡，抑制YAP诱导的转录靶点EGFR表达。最近还有研究发现，BET抑制剂作为临床抗癌治疗的潜力，据报道BET可以阻止YAP/TAZ介导转录，并且可以克服YAP/TAZ引起的耐药性[31, 35]。另外，Kurppa等[38]最近开发出一种新型的共价TEAD抑制剂MYF-01-37、MYF-01-37未表现出单剂毒性的特点，并且使得因EGFR/MEK抑制剂处理进入休眠的细胞重新凋亡，他们发现通过提高靶向疗法的初始疗效最终可能延长癌症患者的治疗反应。

目前LGR5靶向疗法仍大多处于起步阶段，Cao等[36]在体外器官启动和活体肿瘤形成的实验中发现，LGR5消融与5-FU化疗的结合效果较比与sorafenib效果有所提高，但LGR5消融与5-FU化疗结合也会导致小鼠器官抗肝癌活性增强，然而，LGR5消融与sorafenib的结合并未产生增强的抗肿瘤活性，这可能与sorafenib在触发LGR5+CSC池中的温和效果有关。另外，LGR5细胞在肿瘤中的存在可能是动态的，观察到不同原发性肝肿瘤的百分比差异很大，而同位素肿瘤通常含有少于1%的LGR5细胞，而在CRC的晚期与早期相比，LGR5细胞较少，一个推测性的解释可能是肿瘤来自LGR5阳性干细胞，但这些细胞在肿瘤进展过程中被抑制[38]。另外，Hippo和Wnt信号通路之间的串扰也可以作为一种潜在的治疗窗口，用于开发CRC的治疗，将细胞重新编程到再生状态也可以作为一种新的治疗方法加以利用。由于提高的再生能力和致癌潜力均与YAP激活相关，维持其中的稳态平衡就显得尤为重要，因此，在临床应用Hippo/YAP调节剂之前应仔细评估药理作用的持续时间和可逆性。

6 结语与展望

尽管LGR5作为Wnt/β-catenin信号通路靶基因在干细胞中的作用达成了普遍共识，但具体机制仍然具有争议性。越来越多的研究证明，YAP依赖其他信号通路参与LGR5+ISC重编程再生肠上皮的程序，YAP活性的调控在其中发挥着重要作用，由于其活性并不是持续保持的，并且持续的高活性YAP可以清除ISC以维持肠道正常稳态，这对于整个肠道健康而言具有重要意义。虽然目前关于这方面的研究并不多，许多关于YAP与Wnt信号通路之间的报道也是互相矛盾的，本文仅从其中一方面阐述其中机制，并不能完全阐明肠上皮再生的机制，但不可否认其在调控肠上皮再生中的作用。许多研究证明，YAP与LGR5两者表达与肿瘤较差的预后高度相关，YAP在肠道肿瘤生长中的双向调控作用一直受到广泛关注，但关于YAP在肿瘤起始、发展中的作用仍然有待商榷。本文从干细胞的角度阐述可能原因，这种双向调控的具体作用机制和作用方式与细胞组织和肿瘤类型相关，YAP的亚细胞定位及调控下游不同靶基因也可能决定了其作用及功能，以及现在动物实验方案可能并不能达到与在体实验同样的效果这些因素造成实验结果有所差别。细胞可塑性为肠上皮再生提供潜在治疗可能，但人类癌细胞功能可塑性为CRC和其他癌症的治疗带来挑战，由于这些研究大多数是在体外进行的，对生长中的肠组织和癌症组织可塑性的功能探索也因为缺乏追踪系统而受到阻碍，单一的LGR5+CSC靶向治疗是否足以根除癌症仍然存在争议，因此，抑制YAP/TEAD和靶向治疗的组合方案如今受到越来越多的关注。基因特异性方法表明靶向LGR5是暂时有效的，但以LGR5为靶点的基因疗法仍然很可能成为治疗CRC的有效手段，已经有研究[16]显示LGR5可能与肿瘤细胞侵袭和耐药有关，未来研究YAP与LGR5+ISC、LGR5+CSC在肠道再生与肿瘤中的机制及治疗前景具有非常重要的价值。