酸雨对生菜的光合、抗氧化系统和产量的影响研究

钟嘉文，单晓冉，章家恩, *，向慧敏, ，任晓巧，黑泽文，刘清山

1. 华南农业大学资源环境学院，广东 广州 510642；2. 广东省生态循环农业重点实验室，广东 广州 510642；3. 广东省现代生态农业与循环农业工程技术研究中心，广东 广州 510642；4. 农业农村部华南热带农业环境重点实验室，广东 广州 510642

酸雨会对农业生态环境和农作物带来严重影响，产生巨大的经济损失（邢廷铣，2002）。酸雨首先作用于植物叶片，不仅会对其造成可见伤害，如伤斑、叶片发黄甚至叶片坏死等症状（Ramlall et al.，2015），而且会引起植物叶片微观结构变化和膜系统损伤（王成聪等，2014；王月等，2018），降低叶绿素含量和光合速率（王玉魁等，2015），甚至使植物内环境紊乱（Kacharava et al.，2013），抗氧化活性降低（李永裕等，2012），生理代谢受抑制（刘建福等，2012）。但是不同农作物生理生化过程对酸雨胁迫的响应有所不同，Du et al.（2017）研究认为蔬菜类植物相比其他类型的植物更容易受到酸雨的影响，且受到影响的酸雨pH阈值更高。水德聚等（2016）研究发现，pH 5.0以下的酸雨显著降低油菜（Brassica napusL.）的光合色素和脯氨酸含量，显著提高丙二醛（MDA）含量。侯洁等(2012)认为弱酸雨提高菠菜（Spinacia oleraceaL.）叶绿素含量，但强酸雨影响其正常生理代谢，且MDA和游离氨基酸含量均显著降低。林依倔等（2011）研究发现酸雨显著降低白菜（Brassica pekinensis(Lour.) Rupr.）超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性；而余苹中等（2004）发现随着酸雨浓度的升高（5.6—3.5），小白菜（Brassica chinensisL.）和四季豆（Phaseolus vulgarisL.）的过氧化物酶活性不断升高，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶（CAT）活性呈先升高后下降的趋势。

酸雨导致作物减产的原因可以归结为通过降低作物的叶绿素含量和净光合作用，破坏植物体内稳态，导致作物产量下降。研究发现，酸雨会降低水稻的结实率（杨继云等，2016）、大豆（Glycinemax(Linn.) Merr.）的产量（Li et al.，2019）、龙眼（Dimocarpus longanLour.）单果重和可食率（邱栋梁等，2004），油菜（Brassica napusL.）（麦博儒等，2010）、小白菜（赵晓莉等，2007）和菠菜（王双明，2012）等叶菜类蔬菜产量，其中酸雨对蔬菜的影响最大（冯颖竹等，2012）。

蔬菜在我国人民饮食结构中占有重要地位，随着人们生活水平提升，对蔬菜的需求越来越大。根据《中国统计年鉴2019》显示，我国蔬菜种植面积达2000万公顷，与2010年相比扩大了20.7%。酸雨对蔬菜种植的危害必然随着面积的扩大而增加。广东作为一个重要的酸雨分布区，酸雨的频发可能会影响整个广东地区蔬菜的生长，进而降低产量，影响“菜篮子”问题。在广东，蔬菜种植主要以叶菜类为主，占蔬菜种植总面积30%，产量占总蔬菜的31.7%。植物叶片的生理生化容易受到酸雨的危害，而且叶片是叶菜类蔬菜主要食用的部位，因此探究酸雨对叶菜类蔬菜生理生态的影响至关重要。

目前，对生菜的相关研究主要集中在酸雨对生菜品质（赵晓莉等，2006）、生长指标（赵晓莉等，2007）和重金属含量（贾劼等，2008）的影响，但对生菜的抗氧化系统、光合特性和产量的相关研究较少。因此，本文以生菜作为研究材料，探究4种模拟酸雨梯度（pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0和CK）对生菜生理生化过程、光合特性以及产量的影响，旨在为从事生菜栽培的相关农户以及决策部门提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验地点

试验材料选用意大利散叶生菜（Lactuca sativaL. var. ramosa Hort.），由广东省农科院蔬菜研究所提供。试验地位于广东省广州市华南农业大学增城教学科研基地（113°38′E，23°14′N），属于亚热带季风性气候，年平均气温23.1 ℃，土壤为赤红壤。为避免自然降雨对试验的干扰，试验地上搭建试验大棚。整个大棚框架由钢管和水泥柱筑成，棚顶覆盖透明塑料薄膜以遮挡降雨，大棚四周通风无遮挡，保证生菜生长能接受到除降雨之外的其他环境条件。

1.2 试验设计

2019年10月7日开始在试验大棚内育苗，11月2日待生菜生长到3—4 cm时选择生长状况基本一致的幼苗移栽至试验小区，11月11日开始模拟酸雨喷淋试验。根据中国气象局 QX/T 372—2017《酸雨和酸雨区等级》，试验处理设计 pH=3.0、4.0和5.0，分别代表特强酸雨、强酸雨和弱酸雨。试验处理包括pH=3.0、4.0和 5.0的模拟酸雨以及CK（采用当地地下水作为灌溉水，地下水 pH≈6），每个处理4个重复，共16个试验小区，每个小区面积约4 m2（2 m×2 m），试验采取随机区组设计。配置酸雨时按照摩尔浓度比为n(SO42-)∶n(NO3-)=2∶1的比例来配置pH=1的酸性母液，再用灌溉水进行稀释并通过便携式pH计S2-Field Kit进行校正，最后调整为pH=5.0、4.0和3.0的酸雨。根据广东省生态环境保护厅公开发布的《广东省环境状况公报》（广东省生态环境厅，2019）确定酸雨喷施量，采用电动喷头模拟酸雨，喷头流量7—8 L·min-1，每个小区每次喷洒10 min。每3天喷淋1次酸雨，共喷淋酸雨12次。

1.3 测定方法

1.4 数据分析

运用Microsoft Excel 2010进行整理数据。SPSS 21.0进行重复测量方差分析（Repeated Measures ANOVA），当不满足 Mauchly’s球形检验时采用Greenhouse-Geisser方法校正结果，用LSD法进行显著性检验（P＜0.05）。运用Origin 9.0作图，所有测定数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 模拟酸雨对生菜相对叶绿素含量的影响

由图1可知，不同酸雨处理对生菜相对叶绿素含量的主效应具有显著影响（F=6.133，df=3，P=0.008）。处理时间对生菜相对叶绿素含量的主效应具有显著影响（F=174.535，df=2.158，P＜0.001）。不同酸雨处理和处理时间的交互作用对生菜相对叶绿素含量无显著影响（F=1.785，df=6.474，P=0.138）。与CK相比，pH 3.0模拟酸雨处理的相对叶绿素含量显著降低（P＜0.001）；pH 4.0和5.0模拟酸雨处理的相对叶绿素含量与CK 没有显著性差异（P=0.071，P=0.096）。在第10天，pH 3.0模拟酸雨处理较 CK显著降低11.9%。第20天，pH 3.0和pH 4.0模拟酸雨处理下生菜叶片相对叶绿素含量分别较 CK显著降低6.4%和5.3%。不同强度的模拟酸雨处理及对照处理对第30天和第40天叶片相对叶绿素含量的影响未达到显著性差异。

图1 模拟酸雨对生菜相对叶绿素含量的影响Fig. 1 Effect of simulated acid rain on the chlorophyll content of lettuce

2.2 模拟酸雨对生菜光合作用特性指标的影响

2.2.1 净光合速率

由图2A可知，不同酸雨处理对生菜净光合速率的主效应具有显著影响（F=3.963，df=3，P=0.049）。处理时间对生菜净光合速率的主效应具有显著影响（F=22.615，df=3，P＜0.001）。不同酸雨处理和处理时间的交互作用对生菜净光合速率无显著影响（F=0.550，df=6.923，P=0.788）。与CK相比，pH 3.0模拟酸雨处理的净光合速率显著降低（P＜0.001），pH 4.0和5.0模拟酸雨处理的净光合速率与CK没有显著性差异（P=0.136，P=0.579）。整个生长过程中，pH 5.0模拟酸雨处理下生菜的净光合速率与CK没有显著差异，但随着酸度的上升，生菜叶片的净光合速率呈下降趋势。在第 30天，pH 4.0模拟酸雨处理的生菜净光合速率较CK显著降低9.3%。在第10、20、30和40天，pH 3.0模拟酸雨处理的生菜净光合作用均显著低于 CK，分别降低了14.5%、13.3%、8.4%和17.0%。

图2 模拟酸雨对生菜光合作用特性指标的影响Fig. 2 Effect of simulate acid rain on photosynthetic indexes of lettuce

2.2.2 蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度

由图2B—D可知，不同强度酸雨处理对生菜蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度的主效应均无显著影响（P＞0.05）；处理时间对生菜蒸腾速率、气孔导度和胞间 CO2浓度的主效应均具有显著影响（P＜0.001）。但不同强度酸雨处理和处理时间的交互作用对生菜蒸腾速率均无显著影响（P＞0.05）。

2.3 模拟酸雨对生菜抗氧化酶活性的影响

由图3A可知，不同酸雨处理对生菜SOD活性的主效应具有显著影响（F=7.050，df=3，P=0.005）。处理时间对生菜 SOD活性的主效应具有显著影响（F=9.724，df=3，P＜0.001）。不同酸雨处理和处理时间的交互作用对生菜 SOD活性却无显著影响（F=1.778，df=6.281，P=0.142）。与 CK相比，pH 3.0、4.0和5.0模拟酸雨处理的SOD活性均显著升高（P=0.003，P=0.011，P＜0.001）。不同浓度酸雨处理显著提高了生菜SOD活性，在第10天，pH 5.0、pH 4.0、pH 3.0模拟酸雨处理下生菜叶片的SOD活性比 CK分别显著升高 54.6%、32.9%和35.8%。第20天和第30天的pH 3模拟酸雨处理下的SOD活性比CK显著升高52.5%和36.6%。而第40天，pH 3.0模拟酸雨处理降低了生菜叶片SOD的活性，较CK显著降低11.8%。

图3 模拟酸雨对生菜SOD、POD和CAT活性的影响Fig. 3 Effect of simulated acid rain on SOD, POD and CAT activities of lettuce

不同酸雨处理对生菜POD活性的主效应具无显著影响（F=0.602，df=3，P=0.626）。处理时间对生菜POD活性的主效应具有显著影响（F=29.175，df=1.746，P＜0.001）。不同酸雨处理和处理时间的交互作用对生菜 POD活性无显著影响（F=1.680，df=5.237，P=0.182）（图3B）。

王祥在L市里无亲无故，也没个人给他当个导游，去当铺，他害怕像电视里的大头鬼一样被骗了。去商场，他又估摸着那里只有东西买，没有地方卖。他想来想去突然想起电视里播过城里专门有古玩交易市场，于是便抱着试试看的心态去看了看，一看之下王祥大吃一惊。

由图3C可知，不同酸雨处理对生菜CAT活性的主效应具有显著影响（F=10.960，df=3，P＜0.001）。处理时间对生菜 CAT活性的主效应具有显著影响（F=20.345，df=3，P＜0.001）。不同酸雨处理和处理时间的交互作用对生菜 CAT活性无显著影响（F=1.143，df=5.820，P=0.369）。与 CK相比，pH 3.0模拟酸雨处理的 CAT活性均显著降低（P＜0.001），pH 4.0和5.0模拟酸雨处理的CAT活性与CK没有显著性差异（P=0.997，P=0.357）。不同浓度酸雨处理对CAT活性在第10天没有显著性差异。第20天后，pH 3.0模拟酸雨处理较CK显著降低35.2%。第30天和40天，pH 3.0模拟酸雨处理的生菜 CAT活性较 CK显著降低 32.0%和13.8%。

2.4 模拟酸雨对生菜MDA和脯氨酸含量的影响

由图4A可知，不同酸雨处理对生菜MDA含量的主效应具有显著影响（F=6.820，df=3，P=0.006）。处理时间对生菜MDA含量的主效应具有显著影响（F=70.893，df=3，P＜0.001）。不同酸雨处理和处理时间的交互作用对生菜MDA含量却无显著影响（F=0.904，df=7.741，P=0.523）。与CK相比，pH 3.0、4.0和5.0模拟酸雨处理的MDA含量均显著升高（P=0.002，P=0.002，P=0.047）。第10天，不同浓度酸雨提高了生菜 MDA含量，pH 4.0和pH 3.0模拟酸雨处理的生菜叶片MDA分别较CK显著升高24.8%和25.3%。第20天，pH 4.0模拟酸雨处理的生菜叶片 MDA较 CK显著升高30.3%。第30天和第40天不同浓度酸雨处理叶片MDA没有显著性差异。

图4 模拟酸雨对生菜丙二醛和脯氨酸含量的影响Fig. 4 Effect of simulated acid rain on MDA and Proline contents of lettuce

不同酸雨处理对生菜脯氨酸含量的主效应无显著影响（F=0.398，df=3，P=0.757）。处理时间对生菜脯氨酸含量的主效应具有显著影响（F=31.160，df=3，P＜0.001）。不同酸雨处理和处理时间的交互作用对生菜脯氨酸含量无显著影响（F=1.136，df=7.771，P=0.367）（图4B）。

2.5 酸雨对生菜地上部和地下部鲜重的影响

由图5A可看出，不同酸雨处理对生菜地上部鲜重的主效应具有显著影响（F=6.052，df=3，P=0.009）。处理时间对生菜地上部鲜重的主效应具有显著影响（F=555.264，df=1.816，P＜0.001）。不同酸雨处理和处理时间的交互作用对生菜地上部鲜重无显著影响（F=1.691，df=5.448，P=0.175）。与CK相比，pH 3.0和4.0模拟酸雨处理的地上部鲜重显著降低（P=0.002，P=0.005），pH 5.0模拟酸雨处理的地上部鲜重与 CK没有显著性差异（P=0.053）。第10天pH 3.0模拟酸雨处理的地上部鲜重相比CK显著降低29.1%。第20天，pH 5.0、pH 4.0、pH 3.0模拟酸雨处理下的地上部鲜重较CK分别显著降低16.3%、28.3%、26.9%。第30天，pH 4.0和pH 3.0模拟酸雨处理下的地上部鲜重较CK分别显著降低21.8%、29.6%%。第40天，pH 4.0和pH 3.0模拟酸雨处理的生菜地上部鲜重分别较CK显著降低了14.6%和16.7%。

由图5B可知，不同酸雨处理对生菜地下部鲜重的主效应具有显著影响（F=6.746，df=3，P=0.006）。处理时间对生菜地下部鲜重的主效应具有显著影响（F=352.832，df=1.834，P＜0.001）。不同酸雨处理和处理时间的交互作用对生菜地下部鲜重有显著影响（F=2.873，df=5.502，P=0.035）。与CK相比，pH 3.0模拟酸雨处理的地下部鲜重显著降低（P=0.003），pH 4.0和5.0模拟酸雨处理的地下部鲜重与 CK没有显著性差异（P=0.160，P=0.875）。第 10天，不同酸雨处理降低了生菜的地下部鲜重，pH 4.0和pH 3.0模拟酸雨处理的地下部鲜重相比CK分别显著降低20.1%和42.3%。相比CK，第20和30天生菜的地下部鲜重在pH 3.0模拟酸雨处理下分别显著降低18.9%和18.1%。第40天，pH 3.0模拟酸雨处理相比 CK显著降低19.0%。

图5 模拟酸雨对生菜产量的影响Fig. 5 Effects of simulate acid rain on the fresh weight of lettuce

3 讨论

3.1 酸雨对生菜光合系统的影响

光合作用既是植物生物量形成的基础，也是影响植物生长发育的重要生理过程，因此光合作用特性是探究植物在酸雨胁迫下响应的关键指标（王丽红等，2017）。其中，SPAD表示植物相对叶绿素含量，叶绿素是植物进行光合作用的重要物质，其含量在一定程度上与植物光合作用呈正相关，经常用于评价植物的光合作用（赵凯男等，2019）。本研究中，pH 3.0酸雨处理对生菜相对叶绿素含量和净光合作用主效应显著，pH 3.0的酸雨处理显著降低生菜相对叶绿素含量和净光合作用，说明酸雨抑制了生菜叶绿素的合成、光合色素积累变慢，导致光合作用强度下降。这与以往研究结果一致，酸雨会使植物光系统受损，并抑制叶片叶绿体的形成和叶绿素合成（麦博儒等，2008）。在第20天，pH 4.0酸雨也显著降低生菜相对叶绿素含量和净光合作用，说明pH 4.0酸雨也会影响生菜正常生长，而在其他时间段没有显著影响的原因可能是因为植物不断生长过程中对酸雨的抵抗程度不一样（孙静雯等，2017），也有研究发现，植物自身能够一定程度地修复酸雨对其产生的伤害，在特强酸雨下会造成不可修复的伤害（何亚飞等，2016）。植物光合作用受运送 CO2过程的气孔因素和利用 CO2光合器官的非气孔因素的综合影响，气孔变小阻碍气体运送以及光合色素破坏都会对植物光合作用造成影响，主要取决于限制最强的因素（关义新等，1995）。本研究发现，前 20天酸雨处理降低生菜的净光合作用和蒸腾速率，而气孔导度和胞间CO2浓度变化不明显，说明酸雨对生菜叶片气孔影响不大，酸雨主要影响光合色素等非气孔因素来降低生菜光合作用。本研究发现，pH 3.0模拟酸雨处理第40天净光合速率显著降低，此时相对叶绿素含量没有差异，气孔导度显著降低，说明在酸雨持续胁迫下生菜细胞形态发生变化，从而影响光合作用。

3.2 酸雨对生菜抗氧化系统的影响

抗氧化酶系统是植物遭受环境胁迫时重要的防御体系（杨舒贻等，2016），其中SOD是生物体内存在的一种重要抗氧化金属酶，它能够催化超氧阴离子自由基和氢离子反应生成氧气和过氧化氢，在机体抗氧化过程中起到至关重要的作用（刘芸等，2003）。本研究结果表明，pH 3.0、4.0和5.0的模拟酸雨处理下，在第10、20和30天，生菜的SOD活性显著升高，说明酸雨对生菜的抗氧化系统有激活作用，生菜抗氧化能力提高，这与陶巧静等（2014）研究结果一致。Xalxo et al.（2018）的研究发现酸雨胁迫会使植物上调有关抗氧化酶的基因，促进植物抗氧化酶的合成；但在第40天，pH 3.0模拟酸雨处理中SOD活性反而显著下降，这可能是长时间特强酸雨胁迫的累积效应使酶失活的原因，Ren et al.（2018）研究认为虽然酸雨能够激活抗氧化系统，合成更多抗氧化酶来抵抗酸雨的危害，但高浓度酸雨持续胁迫下植物体内的酶和蛋白会被氧化、钝化，导致酶的活性降低。本研究中第10天酸雨处理对CAT活性没有显著影响，第20天之后，pH 3.0模拟酸雨处理下CAT活性显著降低，其原因可能是过量活性氧积累，对酶系统造成破坏，使植物抗氧化能力降低（Livingstone，2001）。本研究中不同抗氧化酶的活性变化和响应时间也存在差异，CAT对酸雨胁迫的响应在SOD响应之后，这与郭慧媛等（2014）研究结果一致。

MDA是过氧化作用的产物之一，其在植物体内的含量表示膜系统受到的伤害程度（侯麟等，2010）。当胁迫超过了植物抗氧化系统所抵御的限度，植物不能及时清除有害物质，导致活性氧大量积累，植物在逆境胁迫中就会发生膜的过氧化作用（刘芸等，2003）。研究表明，酸雨处理会增加植物MDA含量（Ju et al.，2017）。本研究也有相似的发现，在pH 5.0、4.0和3.0模拟酸雨处理对MDA含量的主效应都有显著影响，表明弱酸雨就会对生菜细胞膜造成损伤。

3.3 酸雨对生菜产量的影响

本研究中pH 4.0和3.0模拟酸雨处理对地上部产量的主效应都有显著影响，pH 4.0和3.0模拟酸雨处理显著降低生菜产量，这与张胜楠等（2016）研究结果相似，酸雨的减产会给生产者带来一定的经济损失。本研究中，第10、20天pH 5.0模拟酸雨处理的生菜鲜重无显著差异，而在酸雨处理第30天，pH 5.0模拟酸雨处理的生菜鲜重显著下降，但净光合作用未达到显著差异，原因是生菜将部分用于生长的光能转化为保护自身的能量，启动了能量耗散机制来保护光合组织以免于受到酸雨胁迫的伤害（王雯等，2014）。也有研究表明，植物幼苗受酸雨胁迫后，挥发物和可溶性蛋白含量增加，光合作用产物有部分被用于合成抵抗酸雨的物质（郭慧媛等，2014），这与本研究中SOD活性升高的结果一致，我们认为，pH 5.0酸雨虽然降低其叶绿素含量，对光合作用没有明显抑制，但细胞膜有一定的损伤且抗氧化系统已经响应，生长发育的物质部分被用于合成抗氧化物质，这种累积效应导致pH 5.0模拟酸雨处理下生菜生长减缓且在第30天时出现显著差异。由图5A可以看出在第30天后生菜生长加快，生菜进入营养最大效率期，pH 5.0模拟酸雨处理对生菜伤害不明显，使得在第40天（收获期）时，pH 5.0模拟酸雨处理的地上部产量较CK没有显著影响。也有文献表明，pH 5.0酸雨轻微促进蔬菜（小白菜）的生长发育（张胜楠，2012），这可能与植物种类和处理时间有关。

酸雨处理和时间对生菜地下部产量存在交互作用，由图5B可以看出随着生菜生长，pH 5.0酸雨处理地下部产量达到最高值，且显著高于pH 3.0和4.0酸雨处理，表明在弱酸雨胁迫下生菜可能通过促进地下部生长吸收更多养分来抵消酸雨对生菜地上部的影响，而强酸雨胁迫下生菜生理生化指标都受抑制，导致生菜整体生长变缓。本研究中pH 3.0模拟酸雨处理对地下部产量的主效应有显著影响，且pH 3.0酸雨处理生菜地下部比地上部影响更严重，这与单运峰等（1989）研究结果一致，生菜地下部比地上部更敏感，说明特强酸雨不仅影响生菜叶片的生理生化指标，也显著抑制生菜地下部的生长，从而抑制生菜的整体生物量和产量的形成。

4 结论

pH 5.0的模拟酸雨对生菜光合作用和叶绿素含量没有显著影响，但会激活生菜的抗氧化系统，提高SOD的活性来抵御酸雨带来的胁迫，导致生菜在前30天生长减缓。pH 4.0的模拟酸雨会使生菜MDA含量升高，造成细胞膜系统损伤，使生菜叶绿素含量下降，光合作用减弱，最终导致生菜产量下降。当模拟酸雨pH达到3.0时，生菜叶片损伤持续加重，细胞内抗氧化系统被破坏，最终SOD和CAT活性下降，同时生菜地下部生长受抑制更严重，进一步影响生菜正常生长。pH 4.0以下的酸雨明显降低了生菜产量，且pH 5.0的酸雨有造成生菜减产的风险，因此初步推测，酸雨对生菜生长伤害阈值可能在pH 4—5之间。