核酸适配体在食品危害物多靶标检测中的应用进展

高林晨萌 叶 华 黄圣博 李占明 郭元新 李 超 王周平

(1. 江苏科技大学粮食学院，江苏 镇江 212004；2. 江苏雨润肉食品有限公司肉品加工与质量控制国家重点实验室，江苏 南京 211806；3. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

食品危害物是引发食品安全问题的主要因子，是指食品在生产加工过程中因质量控制不到位而产生的可能导致疾病或伤害的生物性、化学性或物理性因子，包括致病菌、生物毒素、农兽药残留、重金属以及非法添加物等。目前对这些食品危害物检测方法主要有生物鉴定法、色谱法、免疫分析法等[1-2]，这些方法各有优缺点和适用范围，比如生物鉴定法需要进行微生物培养，检测耗时长；色谱法不仅仪器昂贵、前处理繁琐，而且对操作人员技术要求较高；免疫分析法所使用的抗体制备难且容易变性，同时难以应用于无免疫原性的靶标检测[3-4]。近年来，核酸适配体的出现为食品危害物检测技术开辟了一条新途径。核酸适配体是可以通过指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)体外筛选获得的单链DNA或RNA功能序列，它们能特异性结合各种靶标，小到Hg2+、Mg2+等金属离子，大到细胞甚至细菌[5]。由于其具有合成成本低、亲和力高、特异性强等特点，在食品安全检测[6]、生物医学分析[7]、疾病诊断[8]等方面具有广阔的应用前景。

随着人们对食品安全问题的关注，以核酸适配体为分子探针构建的分析检测方法在食品危害物检测方面得到了广泛应用，尤其是在致病菌、生物毒素、重金属等食品危害物单靶标方面的分析检测。单靶标检测技术针对性强，由于无需考虑其他靶标的影响，一般来说试验设计简单，很受研究工作者欢迎。然而很多食品危害物如沙门氏菌、大肠埃希氏菌等致病菌，黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A等真菌毒素并不是单独存在于某一食品或食品原料中，实际上多是同时共存。因此，单一的危害物靶标检测有可能顾此失彼，难以全面评价食品的安全性，多靶标同时检测是未来检测技术发展的必然趋势。尽管可以通过多次单靶标检测进行安全监测和分析，但这样的检测方式耗时长，有可能有潜在危害的食品或食品原料已进入流通市场或人们的消费餐桌上，造成食源性疾病事件的发生。另外多次单靶标检测取样用量多、经济成本高，容易造成资源浪费，增加食品安全监管成本。因此，多靶标同时检测具有良好的时效性、经济型和高效性。近年来相关研究报道逐年增多，然而目前尚未有基于核酸适配体技术的食品危害物多靶标同时检测技术的相关综述报道。基于此，文章拟对近年来利用核酸适配体技术实现食品危害物如致病菌、毒素、重金属离子的多靶标检测研究进展进行总结，以期为今后开发基于核酸适配体技术的高灵敏、高通量多靶标快速检测方法和产品提供借鉴和指导，继而推动核酸适配体在食品安全检测领域方面的发展。

1 食品危害物核酸适配体现状

自20世纪90年代Tuerk等[9]和Ellington等[10]报道核酸适配体技术以来，经过30年的发展，广大科研工作者开发了很多新的核酸适配体筛选技术，获得上千种靶标物质的核酸适配体。在食品安全领域，致病菌、生物毒素、农兽药、重金属离子等危害物受到广泛关注，已通过建立的各种筛选方法筛选获得并得到应用。表1列举了已报道筛选或应用的各类食品危害物核酸适配体情况。由表1可以看出，自2008年以来，至今已有60余个食品危害物核酸适配体被报道成功筛选获得，主要为生物毒素、抗生素、致病菌、重金属和农残兽残等几大类，且大多都是ssDNA核酸适配体，仅有大肠埃希氏菌O157、妥布霉素、达氟沙星、环丙沙星、孔雀石绿5种危害物筛选过RNA核酸适配体。这主要是由于ssDNA比RNA相对稳定，在生物传感器开发和应用上更受青睐。从序列长度来看，致病菌、生物毒素等大分子危害物核酸适配体序列基本上都是在80 bp左右，即是从筛选文库中直接筛选获得的。而抗生素、重金属离子、有机磷农药等小分子危害物核酸适配体序列长度大多经过截短优化，缩短为21～66 bp，优化后其仍然具有较好的亲和性和特异性，有利于其生物传感器性能的提升和经济成本的降低[70]。

2 食品危害物多靶标同时检测

2.1 致病菌多靶标同时检测

主要的食源性致病菌如金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和致病性大肠埃希氏菌等，目前已有利用核酸适配体作为分子探针，构建了对多种致病菌的同时检测方法，效果良好。如Zhang等[71]基于核酸适配体特异性识别技术和纳米离子增强拉曼信号原理，构建了对鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行同时检测的拉曼核酸适配体生物传感器，最低检测限分别达15，35 CFU/mL。Li等[72]也采用表面增强拉曼技术和金纳米棒建立了大肠埃希氏菌O157：H7和鼠伤寒沙门氏菌的同时检测。这个生物传感器的设计策略是适配体不仅作为生物识别分子，还和拉曼报告分子一起诱导金纳米棒生长成特定的形状从而增强拉曼信号实现灵敏检测。Wang等[73]则将鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体和金黄色葡萄球菌核酸适配体分别标记在NaGdF4:Eu和NaYF4:Ce/Tb两种掺镧时间分辨荧光纳米颗粒上作为信号探针，以Fe3O4磁性纳米颗粒固定化的核酸适配体作为捕获探针，在同一波长的激发光下进行激发，产生不重叠的发射光谱，从而实现了鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的核酸适配体同时检测技术。通过优化试验条件，检测限分别达15，20 CFU/mL，且在102～105范围内具有很好的线性关系，在实际样品检测中与平板计数法结果具有较好的一致性。

除两种致病菌同时检测之外，Lu等[74]基于双适配体夹心模型设计了一种核酸适配体测流试纸条，实现了鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7和金黄色葡萄球菌3种致病菌的同时检测，检测原理如图1所示。但该方法灵敏度相对较低，其LOD分别达103，104，104CFU/mL。由此可见，两种以上的致病菌多靶标检测由于标记的多样性和体系的复杂性，其检测难度加大，检测限下降明显，还有提升的空间。

2.2 生物毒素多靶标同时检测

生物毒素是引发食品安全问题的主要因素之一。生物毒素按其来源可分为细菌毒素、真菌毒素、动物毒素、植物毒素、海洋生物毒素等，种类繁多、分布广泛，通常以某种高特异性方式作用于离子通道、酶、受体、基因等靶位，其中微生物毒素不仅影响范围广，而且危害极大。目前已报道筛选获得的生物毒素类核酸适配体有金黄色葡萄球菌肠毒素核酸适配体、黄曲霉毒素B1核酸适配体、赭曲霉毒素A核酸适配体、T-2毒素核酸适配体、微囊藻毒素等，这些毒素核酸适配体筛选的获得为它们的多靶标检测技术的构建奠定了良好的基础。Huang等[75]则利用筛选获得的金黄色葡萄球菌肠毒素A、B和C1核酸适配体分别作为识别探针，以互不干扰的多色镧系参杂纳米颗粒为信号探针，利用氧化石墨烯作为荧光猝灭剂构建了基于多色时间分辨荧光共振能量转移的检测技术，实现了3种肠毒素的同时检测，其检测限分别达0.062，0.069，0.040 ng/mL，具有较好的灵敏性和高通量特点。

然而目前生物毒素多靶标检测报道较多的还是两种靶标的同时检测，且其检测灵敏度明显高于3种毒素的同时检测。如王成全[76]将赭曲霉毒素A和伏马菌素B1核酸适配体偶联量子点形成纳米生物复合物，建立了基于SiO2@Cd Te和SiO2@Pb S为标记物的电化学核酸适配体生物传感器实现了玉米样品中两种真菌毒素的同时检测，最低检测限分别达5，20 pg/mL。Qian等[77]利用核酸适配体构建了一种磁控荧光生物传感器实现了赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1的同时检测，检测原理如图2 所示。不仅检测线性范围宽，而且检测限达到皮克数量级，分别达0.67，1.70 pg/mL。Wang等[78]将玉米赤霉烯酮核酸适配体和赭曲霉毒素A核酸适配体分别标记Cy3和Alexa Fluor488荧光基团作为分子探针，设计了一种基于氧化石墨烯的核酸适配体生物传感器，实现了两种毒素的同时检测，最低检测限分别达1.797，1.484 ng/mL。综上，利用荧光标记技术在生物毒素同时检测方面应用更为常见，主要是利用在不同的核酸适配体分子上标记不同的荧光分子构建相应的检测方法从而实现检测，但是荧光标记一定程度上增加了检测成本。

2.3 农兽药残留多靶标同时检测

在农作物生产和畜产养殖过程中，为了保证其良好生长和健康成长，通常要使用农药和兽药，因此农兽药残留在农产品、畜产品中较为常见。中国是农业大国，农兽药残留是食品安全监督管理部门重点监测方向之一。农兽药分子的核酸适配体筛选目前报道将近20种(见表1)，以它们为分子探针开发的同时检测技术报道近年来逐渐增多。如周佳伟[79]基于核酸适配体识别和量子点技术构建了一种荧光生物传感器用于卡那霉素和妥布霉素的同时检测，最低检测限分别为0.11，0.21 mg/L，并成功应用于牛奶产品中的卡那霉素和妥布霉素残留检测。王叶[80]结合荧光法和微流控方法构建了一种新型的适配体生物传感器用于同时检测卡娜霉素和氯霉素残留，经优化试验条件，其最低检测限分别为0.7，0.9 pg/mL。

表1 已报道的食品危害物核酸适配体情况

图1 构建核酸适配体测流试纸条实现3种致病菌同时检测原理图[74]

图2 磁控荧光生物传感器同时检测OTA和AFB1设计原理图[77]

除了利用多条核酸适配体实现多靶标同时检测之外，人们还通过改进筛选技术或裁剪优化序列获得广谱型核酸适配体，用于同一类危害物分子的同时检测。如Kwon等[70]对长度76 bp的土霉素OTC核酸适配体进行一级结构序列同源性分析，获得保守序列并对其加以优化最终获得一条长8 bp的广谱型四环素类核酸适配体，它能同时识别四环素、土霉素、脱氧土霉素、氯四环素4种抗生素，并以此为分子探针构建了超灵敏比色法实现了多种抗生素的同时检测，检测原理如图3所示。该方法的最低检测限达0.1 nmol/L。而Zhang等[81]通过裁剪、突变等手段设计了一种有机磷农药的广谱适配体，并结合分子信标技术实现了对4种有机磷农药(甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧化乐果)的同时检测。这些通过下游工程改造核酸适配体分子探针为广谱型探针，实现了一个核酸适配体分子探针能同时识别多个危害物靶标，在定性分析中具有较好的应用前景。

2.4 重金属多靶标同时检测

随着工业化进程的加快发展，工业三废给生态环境带来严重危害，尤其是汞、镉、砷、铅等的排放不仅污染了土壤、水资源，还对其周围种植养殖的农作物、畜产品及水产品等带来危害，进而通过食物链进入人体，可能聚集于某些器官造成慢性中毒，对人类健康危害极大[82]。目前汞、镉、砷、铅等重金属的核酸适配体均已成功筛选并报道，因此，基于核酸适配体的多种重金属同时检测方法相应受到关注。如Wu等[83]引入双色上转换荧光纳米颗粒构建了一种可控的金纳米材料为荧光能量受体的双重荧光共振能量转移检测体系，实现了Pb2+和Hg2+的同时检测，其检测限分别为50，150 pmol/L。Khoshbin等[55]开发了一种简单易行、快速灵敏的纸基核酸适配体传感器，可在10 min内完成Hg2+和Ag+的同时检测，其检测限分别低至1.33，1.01 pmol/L，且成功应用于水、牛奶等实际样品的分析检测。周羽婷等[54]用Hg2+、Pb2+和Sr2+离子核酸适配体作为分子探针，根据核酸结构转换原理，结合纳米孔膜技术开发了一种新型高灵敏电化学传感器，实现了3种金属离子的分步同时检测。该电化学传感器具有优秀的灵敏性和选择性，最低检测限分别达0.013，0.017，0.022 nmol/L。

图3 四环素类广谱型核酸适配体设计原理图

2.5 非同类型危害物多靶标同时检测

除了同一类型危害物多靶标的同时检测技术外，还有学者报道了不同类型食品危害物混合多靶标同时检测技术。这种不同类型危害物多靶标同时检测体系可能更复杂，但是更能适应实际需求。如Yan等[84]利用Fe3O4和SiO2纳米颗粒作为载体，将赭曲霉毒素A适配体和ATP适配体通过非共价键方式固定在纳米颗粒上，建立了一种发光化学分析法，实现了啤酒样品中赭曲霉毒素A和ATP的同时检测。该检测方法线性范围宽，回收率好，最低检测限分别达9.02，9.31 nmol/L。除了两种不同类型危害物同时检测外，Jin等[85]还设计了3种不同类型危害物的同时检测方法，将Hg2+、赭曲霉毒素A和沙门氏菌核酸适配体分别标记在不同上转换纳米材料上，构建了一种测流适配体分析技术，并结合智能手机开发了一种便携式检测设备，该方法灵敏特异、操作方便，可满足现场快速检测要求，其最低检测限分别为5 ng/mL，3 ng/mL 和85 CFU/mL，进一步研究表明其可在30 min内完成水样中3种危害物的同时检测。He等[86]则将卡那霉素、黄曲霉毒素M1和17β-雌二醇3种核酸适配体分子探针组装到磁性纳米颗粒上，建立了一种微流控芯片技术实现了多靶标同时检测，检测原理如图4所示。最低检测限分别达0.32，0.95，6.80 pg/mL。该微流控芯片不仅解决了复杂基质的干扰问题，还极大地增强了检测的灵敏性和选择性，而且检测性能稳定，耗时短，3 min即能实现牛奶样品中卡那霉素、黄曲霉毒素M1和17β-雌二醇3种靶标的同时检测。

图4 基于磁纳米三元DNA分子探针的微流控芯片同时检测卡那霉素、黄曲霉毒素M1和17β-雌二醇原理图[86]

3 展望

综上所述，核酸适配体作为分子探针在食品安全检测研究领域的应用已取得了一定的成果，多靶标高通量检测技术的开发是未来发展必然趋势。结合当前研究开发现状和未来实际应用需求，基于核酸适配体技术的食品危害物生物传感器的研发还需在以下4个方面加强研究：① 要进一步加大单靶标检测向多靶标同时检测转变的力度，结合新兴的科学技术进行学科和技术交叉融合，开发更多、更灵敏、更快速而准确的高通量检测方法，其中微流控芯片是未来重点发展的方向之一；② 要进一步通过截短、裁剪等方式优化核酸适配体序列，在获得性能更好的分子探针基础上，短序列不仅有利于多靶标同时检测生物传感器的设计还有利于降低经济成本；③ 要进一步拓宽多靶标食品危害物检测方法范围，当前主要以荧光法为主，核酸适配体需要进行荧光标记，这在一定程度上增加了检测成本，因此免标记的同时检测方法具有较好的开发和应用前景；④ 要进一步加强快速、灵敏、便携的检测设备的研发，可利用大数据技术、可视化技术、人工智能技术等开发基于核酸适配体分子探针的现场快速检测设备，以满足实际应用需求。相信随着科技的不断发展和广大科研工作者的不懈努力，基于核酸适配体的高灵敏、高通量的多靶标快速检测技术必将迎来美好的春天。