调控成骨细胞分化的信号通路及细胞因子研究进展

赵锐 王译晗 朱悦 陶琳 单军

【摘要】 骨质疏松症是临床常见的代谢性骨病。骨质疏松的发生是由各种原因导致的成骨细胞介导的骨生成减少或破骨细胞介导的骨吸收增加。骨生成作用主要由成熟的成骨细胞完成，成骨细胞主要来源于间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），在一系列信号通路及细胞因子等的调控下，MSCs可以分化为成骨细胞，进而发挥骨生成作用。因此增强成骨细胞的分化能力至关重要。目前已知多条信号通路参与到MSCs向成骨细胞分化的过程中，例如Wnt/β-catenin、BMP-Smads、Hedgehog、Notch、PI3K/AKT、MAPKs信号通路等，同时Runx2、Osterix或PPARγ等关键转录因子也在成骨分化过程中起到重要调控作用，这些信号通路与转录因子的激活或抑制影响着MSCs向成骨细胞或脂肪细胞的分化倾向，但这些信号通路与转录因子之间是否存在相互联系，以及它们是如何协同发挥调控成骨细胞分化的作用目前尚不明确。因此，本文针对成骨细胞分化相关重要信号通路以及转录因子研究进展做一综述，为临床上大量的骨代谢异常相关疾病寻找发病机制以及治疗靶点。

【关键词】 成骨分化 信号通路 Runx2 Osterix

Advances in Signaling Pathways and Cytokines Regulating Osteoblastic Differentiation/ZHAO Rui， WANG Yihan， ZHU Yue， TAO Lin， SHAN Jun. //Medical Innovation of China， 2021， 18（05）： -176

[Abstract] Osteoporosis is a common clinical metabolic osteopathy. Osteoporosis occurs due to decreasing of bone formation by osteoblasts or increasing of bone resorption by osteoclasts. Bone formation is done by mature osteoblasts， which are mainly derived from mesenchymal stem cells （MSCs）. MSCs can differentiate into osteoblasts under the control of a series of signalling pathways and transcription factors. Therefore， it is important to enhance the differentiation of osteoblasts. Several signalling pathways are known to be involved in MSCs differentiation into osteoblasts， such as Wnt/β-catenin， BMP-Smads， Hedgehog， Notch， PI3K/AKT， MAPKs signalling pathways， meanwhile transcription factors such as Runx2， Osterix and PPARγ also play an important regulatory role in osteoblast differentiation. The activation or suppression of these signalling pathways and transcription factors affect tendency of MSCs differentiation into osteoblasts or fat cells， but it is not clear whether these signalling pathways and transcription factors are related to each other and how they work together to regulate osteoblast differentiation. Therefore， this paper makes a review of the important signalling pathways and transcription factors related to osteoblast differentiation， and seeks the pathogenesis and treatment targets for a large number of bone metabolic abnormality-related diseases in clinical.

[Key words] Osteoblast differentiation Signalling pathway Runx2 Osterix

First-authors address： Shenyang Orthopedic Hospital， Shenyang 110044， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.05.043

骨質疏松症是临床常见的代谢性骨病，一般表现为骨量减少、骨脆性增加，进而导致骨折风险增高等。成骨细胞介导的骨生成与破骨细胞介导的骨吸收之间的平衡维持着骨的稳态[1]。骨质疏松的发生由各种原因导致这种平衡被打破，出现成骨细胞介导的骨生成降低或者破骨细胞介导的骨吸收增加。骨生成作用主要由成熟的成骨细胞完成，成骨细胞主要由间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分化而来，间充质干细胞具有可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等的能力，在一系列信号通路及细胞因子的调控下，MSCs可以分化为

成骨细胞，并在进一步调控下成为成熟的成骨细胞，发挥骨生成作用。因此增强成骨细胞的分化及成熟能力至关重要。所以，为了更好地揭示成骨细胞分化及骨形成过程的机制，迫切需要阐明这些信号通路及细胞因子是如何在成骨细胞分化过程中发挥调控作用，以期在骨质疏松症的治疗中寻找新的药物靶点。现对参与调控成骨细胞分化的重要信号通路及细胞因子做一综述。

1 参与成骨分化调控的细胞因子Runx2与Osterix

Runx2也称核心结合因子1（Cbfa1），属于Runt结构域基因家族成员之一，因为在成骨细胞的分化和成熟过程中起着至关重要的作用[2-3]，同时可以抑制MSCs向脂肪细胞的分化[4]，所以被认定为成骨分化过程中最重要的转录因子之一。体内实验证实，敲除Runx2基因的小鼠显示出完全性骨生成障碍[5]。Runx2与成骨细胞中碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）、Ⅰ型胶原蛋白（COLL-1）、骨脂蛋白（BSP）及骨桥蛋白（OPN）等主要成骨分化相关基因的表达密切相关，因为以上基因的启动子序列中都存在成骨特异性顺式元件（OSE），而Runx2能够与之结合，从而激活这些相关基因的表达[6-7]。

Osterix（Osx）同样是与成骨细胞分化过程密切相关的一种转录因子。有研究表明，敲除小鼠Osterix基因后，小鼠体内骨皮质和骨小梁发育障碍，证实了Osx与Runx2同样是成骨细胞分化过程中所必需的关键转录因子，进一步研究发现Runx2基因敲除小鼠体内的Osx同样不表达，提示Osx的表达受Runx2调控，Osx位于Runx2的下游[8]。

2 参与成骨分化调控的信号通路

骨形成受多种合成代谢信号通路的调节，包括PI3K/AKT、Wnt/β-catenin、BMP/TGF-β/Smad、MAPK、Notch、Hedgehog等信号通路[9-12]。这些信号通路通过调控Runx2的表达，进而影响骨形成[10，13-14]。下面对重要的成骨分化相关信号通路构成以及目前研究现状做一概述。

2.1 Wnt/β-catenin信號通路 Wnt信号通路分为经典和非经典信号通路。其中，经典Wnt信号通路（即Wnt/β-catenin通路）被认为是在成骨细胞分化过程中起到重要调控作用的信号通路之一。经典Wnt/β-catenin信号通路由Wnt配体及其受体以及细胞内信号分子等组成，其成员主要包括膜外Wnt蛋白（配体）、卷曲蛋白受体（frizzled receptors）、低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP5/6）、连环蛋白（β-catenin）、糖原合成激酶3β（GSK3β）、下游靶基因（如Runx2、Osterix等），以及其他与Wnt/β-catenin信号通路相关的因子，如Dkks（Dickkopfs）、SCF β-TrCP等。

研究表明，当细胞外缺乏Wnt蛋白时，GSK3β以复合体形式存在，复合体形式下的GSK3β可磷酸化β-catenin，磷酸化的β-catenin会被E3泛素连接酶SCFβ-TrCP识别结合后经由泛素蛋白酶体系统降解，从而降低胞质内β-catenin的浓度，进而阻断Wnt/β-catenin信号通路[15]。Wnt/β-catenin信号通路的激活需要Wnt蛋白激活细胞表面的Frizzled受体，并进一步与LRP5/6受体结合，抑制GSK3β的活性，阻止β-catenin磷酸化，保持了β-catenin蛋白的稳定，使未磷酸化的β-catenin转移至细胞核内，进而增加TCF/LEF的转录活性和成骨相关基因的表达。

Wnt/β-catenin信号通路具有促进成骨分化和抑制成脂分化的作用[16]。这种作用已在多种细胞模型中被证实。例如，在3T3-L1细胞系中，Wnt/β-catenin信号通路和成脂特异性转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）相互调节以调控细胞的成脂分化趋势[17]。加入Wnt3a可增强BM-MSC和C3H10T1/2细胞的成骨分化，同时抑制向脂肪细胞的分化[18-19]。加入Dkk1，可加强3T3-L1细胞成脂分化效果，敲除Dkk1导致MSCs的成脂分化效应降低，而MC3T3-E1细胞和BM-MSCs成骨分化效应增强[17，20]。

Wnt/β-catenin信号通路在调节成骨细胞分化及骨形成方面最终作用于Runx2，Wnt/β-catenin信号通路通过调控Runx2的表达，进而发挥Runx2调节成骨分化相关基因ALP、OCN、COLL-1、BSP及OPN等表达的作用，促进了成骨细胞的分化与成熟。Runx2基因启动子序列中存在一个TCF作用元件，β-catenin通过与此作用元件进行结合，继而启动Runx2及下游靶基因的表达，从而对成骨细胞分化及骨形成进行调控[21]。

2.2 BMP/Smads信号通路 在参与成骨细胞分化过程的众多信号通路中，BMP/Smads信号通路是激活成骨细胞分化及骨形成十分重要的一条通路。BMPs是TGF-β超家族中的重要成员。其中BMP2、4、7、9等，在成骨细胞分化过程中起到重要的调节作用，因此被认为是目前骨代谢领域的研究热点之一[22]，同时多数学者认为BMPs对成骨细胞分化的调控作用更具有特异性[23]。BMP/Smads/Runx2/Osterix信号通路被认为是介导成骨细胞分化最重要以及最特异性的通路之一，研究表明，BMPs通过结合细胞膜上特异性受体进而激活BMP/Smads通路，使下游的Smads蛋白（如Smad1、5）发生磷酸化，然后进一步启动成骨细胞特异性转录因子基因（如Runx2、Osterix等）转录，Runx2、Osterix继续促进成骨分化相关基因ALP、OCN、COLL-1、BSP及OPN等的表达，从而增强了MSCs向成骨细胞分化及骨形成的能力[10，23]。

泛素蛋白酶体系统在BMP/Smads信号通路中发挥了重要调控作用，特别是属于E3泛素连接酶的Smurf蛋白，其中最具代表性的Smurf1，它能特异性识别和结合Runx2及Smad1，促使它们经过泛素蛋白酶体途径降解，进而抑制了由BMP/Smads信号通路介导的成骨细胞分化及骨形成[24-25]。human MSCs（hMSCs）细胞在经过成骨诱导后泛素特异性蛋白酶USP34的表达增加，敲除USP34会抑制hMSCs细胞成骨分化。选择性敲除小鼠MSCs细胞中的USP34导致细胞骨形成能力下降。此外，USP34的缺失会减弱BMP2介导的骨分化，进而损害骨生成能力，而进一步敲除Smurf1恢复了USP34缺失MSCs细胞在体外的成骨潜力。证明了，USP34通过减弱Smurf1介导的泛素化降解Smad1和Runx2的能力，稳定了Smad1和Runx2，进而促进成骨细胞分化及骨形成[26]。有研究表明，TGF-β/BMP-2信号通路是在成骨细胞分化晚期细胞成熟过程中，而非早期发挥主要作用[27]。

由此可见，BMP/Smads通路是参与调控成骨细胞分化的重要信号通路之一，与Wnt/β-catenin信号通路类似，BMP/Smads信号通路可通过作用于Runx2、Osterix从而起到增强MSCs向成骨细胞分化的效果，同时其自身也受到多种因素的调节，例如蛋白磷酸化、泛素化途径等。

2.3 Hedgehog信号通路 Hedgehog信号通路是由Hedgehog相应配体（Ihh、Shh、Dhh）、受体（Ptc、Smo）及细胞内信号分子（Gli）等组成。缺失Hedgehog蛋白时，Ptc抑制Smo的活性;当Hedgehog与Ptc1受体结合后，Smo受体被激活，激活的Smo进一步激活Gli，促使它们入核，进而启动下游靶基因的表达。

近期研究发现，Hedgehog信号通路主要参与促进MSCs向成骨细胞分化，并阻止其向脂肪细胞分化[28]，而且这种作用是通过调控Runx2的表达而实现的[2，29-31]。其中，Shh在成骨分化早期而Ihh主要在分化后期起主要作用[32-33]。研究表明，在MSCs细胞中，过表达Gli2能增强成骨细胞分化及矿化能力，敲除Runx2后这种促进效果被消除[29];而在未敲除Runx2的MSCs中，通过降低Gli2的表达能显著抑制Ihh介导的成骨分化，证明了Ihh及Gli2对成骨分化具有促進作用，同时这种作用依赖于Runx2的表达增高。有研究证明Runx2对Hedgehog信号通路也存在调节作用，Runx2可以直接调节软骨细胞、成骨前体细胞和成骨细胞中的Ihh表达，同时可以影响成骨前体细胞和成骨细胞中的Gli1和Ptc1表达[34]。同时也有实验证明，在细胞成骨分化过程中Hedgehog信号通路的调节作用不是持续存在的，在某些成骨分化阶段其他调节成骨分化信号通路发挥主导作用，例如Wnt通路等[31]。

总之，Hedgehog信号通路与Wnt/β-catenin、BMP/Smads信号通路一样具有通过调控Runx2的表达来调节成骨细胞分化及骨形成的作用，因而同样被视作调控成骨细胞分化及骨形成的关键信号通路之一，但这种调控作用是由Hedgehog信号通路单独直接调控，还是必须借助Wnt/β-catenin或BMP/Smads信号通路而协同发挥作用尚无法确定，此外，对于Hedgehog信号通路于体内外发挥促进成骨分化作用是否存在时限性仍有争议。

2.4 其他参与成骨分化的信号通路 大量实验证实，Notch信号通路在调节MSCs向成骨细胞分化过程中起到重要作用，但得到的研究结果并不完全一致，多数研究认为Notch信号通路发挥抑制成骨细胞分化以及降低骨量的作用[35-37]。另一方面，也有研究表明，Notch信号通路在体外具有促进成骨细胞分化的作用，而且这种促进效果伴随着BMP2的表达增加[38]。PI3K/AKT信号通路在许多细胞活动中起着重要作用，如细胞生长、增殖等[39]。最近的研究证明，PI3K/AKT信号通路在成骨分化过程中可能起到重要调控作用[40-41]。有研究表明，MAPKs家族成员JNK、ERK和p38MAPK信号通路通过调控成骨分化而影响骨骼的形成[42-43]，同时p38MAPK和Prkd1信号通路参与MC3T3-E1细胞的在缺氧条件下的成骨分化[44]。

3 调控成骨分化的细胞因子、信号通路之间的联系

目前认为Runx2在成骨细胞分化的起始阶段发挥主要作用，诱导MSCs分化为未成熟的成骨细胞。而Osx的进一步作用导致成骨细胞的最终分化与成熟，Runx2作为Wnt/β-catenin信号通路下游的信号因子，而Osx是BMP-Smads信号通路下游的信号因子，有文献认为成骨分化早期Wnt/β-catenin信号通路起主要调控作用，而分化后期BMP-Smads信号通路发挥主导作用使成骨细胞进一步分化成熟[45]。有研究表明，Akt可以通过增强Runx2的稳定性和转录活性，进而促进BMPs介导的成骨分化[10]，说明Akt信号通路与BMP-Smads信号通路之间存在着相互影响。多项研究证明，Hedgehog信号通路与BMP2发挥协同作用促进MSCs的成骨分化[2，46]。实验证明，Notch信号通路发挥抑制成骨细胞分化的效果是通过降低Wnt/β-catenin信号通路活性而达到的[35]，同时这种抑制效果伴随着Runx2的表达降低，BMP信号通路可能也参与到对成骨分化抑制的调控[36]，但也有文献表明这种抑制分化效果是通过降低Wnt/β-catenin信号通路活性而非BMP信号通路[37]。

综上所述，MSCs向成骨细胞分化的调控机制十分复杂，Wnt/β-catenin、BMP-Smads、Hedgehog、Notch、PI3K/AKT、MAPKs等多条主要信号通路可以通过直接或间接作用于Runx2、Osterix或PPARγ等关键转录因子，而调节MSCs向成骨细胞或脂肪细胞的分化倾向，并且这些信号通路不是孤立存在的，它们通过作用于共同的转录因子，或在调控分化过程中的不同时期发挥主导作用而彼此相互联系，协同参与调控成骨细胞分化。同时通过对这些成骨分化信号通路以及转录因子的深入研究，发现它们被激活或抑制的机制也十分复杂，蛋白磷酸化、蛋白泛素化途径、长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）、微小RNA（microRNAs，miRNAs）、外泌体Exosomes（Exos）等都对成骨细胞分化信号通路以及转录因子有重要的调控作用。因此，还需要在现有研究基础上，全面的、深入的针对成骨分化相关重要信号通路以及转录因子开展机制研究，为临床上大量的骨代谢异常相关疾病寻找发病机制以及治疗靶点。

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（收稿日期：2020-06-03） （本文編辑：张爽）