植酸及其检测方法研究进展

袁长梅，贺晓云，马丽艳，周子莹，唐小革，黄昆仑

1.中国农业大学食品科学与营养工程学院（北京 100083）；2.农业农村部农业转基因生物安全评价（食用）重点实验室（北京 100083）

植酸（Phytic acid）最早是Pfeffer于1872年从糊粉谷物中发现的，又称为肌醇六磷酸酯，即环己六醇的六磷酸酯（IP6），普遍存在于植物中，尤以谷物和种子中含量最为丰富[1]。植酸作为动植物生长发育必需的营养元素，是种子中磷的主要贮存形式，占总磷含量的50%～90%，对维持植物体内磷的平衡有重要的作用[2]。这种分子的磷原子不能轻易被人类利用，因为人体不能产生分解植酸的植酸酶[3]。植酸在自然界中一般不以游离态存在，主要以其与铁、锌、钙、镁等金属离子形成的一种复盐（俗称菲汀）形式存在[4]。单胃动物（人和非反刍动物）的消化道由于没有植酸酶而很难吸收、利用植酸盐。一方面，这些微量元素的生物有效性大大降低，造成微量元素缺乏症；另一方面，大量未经吸收利用的植酸盐随动物粪便的形式排出，造成土壤污染和水体富营养化等环境问题[5]。植酸盐（Phytates）还会与蛋白质形成难以降解的复合体，使人和动物对蛋白质的生物利用率降低，从而影响机体的正常代谢[6]。这种抗营养作用对素食者的影响更严重，因为植酸盐在纤维膳食中的含量要高于其他膳食[7]。近年来人们对于植酸进行深入研究，也发现了植酸的许多有益作用。植酸盐因其对金属离子较强的螯合能力，使之呈现多种重要的生理活性和保健功能，其降解产物大多在细胞信号传导过程中发挥作用，有些还有抗癌和降血压等活性[8]。植酸盐是提取肌醇的最佳原料，有良好的生理作用与保健作用，可用于治疗肝病等疾病[9]。鉴于其抗营养作用以及生理保健功能，植酸（盐）受到人们越来越多的关注。简要介绍了植酸的理化特性及存在形式，重点研究和比较了植酸的各类检测方法，分析其存在的问题，为未来植酸的深入研究奠定基础。

1 植酸的结构特点

植酸又称为肌醇六磷酸，即环己六醇的六磷酸酯（InsP6），分子式为C6H18O24P6，相对分子质量为660.08。其结构是肌醇的6个羟基被磷酸酯化生成的肌醇衍生物，包括6个磷酸基团和12个解离氢（图1）。植酸分子中的12个氢解离常数（pKa）各不相同，在不同的pH条件下，植酸分子可能完全去质子化或者部分去质子化。Burgos-Lujan等[10]运用核磁共振和pH滴定发现，在pKa1.1～2.1强酸性范围内，植酸分子中的6个氢发生解离；在pKa5.7弱酸性范围内，植酸分子中1个氢发生解离；在pKa6.8～7.6范围内，植酸分子中2个氢发生解离；在pKa10.0～12.0范围内，植酸分子中3个氢发生解离。这种范围广泛的pKa会影响植酸分子螯合金属离子和蛋白质分子的数量。根据不同pH条件下有多少个氢去质子化，植酸显示出极高的负电荷密度，具有强大的螯合能力，可以螯合不同个数的金属离子，形成不同结构的配合物[11]。

2 植酸检测方法

植酸的检测方法主要有直接测定法和间接测定法。直接测定法主要分为两大类：一类是利用植酸螯合金属离子，从而使金属离子形成的络合物发生褪色反应来测量其含量，比较常见的是利用植酸和三价铁的络合反应进行定量的方法；另一类是直接从样品中提取分离测定植酸的含量。研究表明植酸盐在内源植酸酶的作用下可以水解成低级肌醇磷酸盐（InsP5、InsP4、InsP3等，见图2），尤其对于加工食品，在一系列加工过程中，内源植酸酶被激活，部分植酸被水解成低级肌醇磷酸盐。InsP5已经被证实会降低矿物质的生物可利用性，具有4个或更少磷酸基团，似乎对矿物质吸收没有任何负面影响，低级肌醇磷酸盐降低了植酸盐原有的抗营养作用[12]。因此加工食品中植酸盐（InsP6）的测定需要与低级肌醇磷酸盐分离测定，才能对样品中植酸含量进行准确定量。间接测定法主要分为两大类：一类是利用植酸与其他物质的反应，通过测定该物质的减少，间接测定植酸含量的方法；另一类是通过测定植酸水解产物中的磷或者肌醇，对植酸进行间接定量的方法。

图1 植酸结构

图2 肌醇磷酸盐结构

2.1 直接测定法

2.1.1 分光光度法

植酸测定的分光光度法最常见的是测铁分光光度法，该法是以磺基水杨酸为显色剂，磺基水杨酸与Fe3+形成紫红色络合物，植酸能螯合其中的Fe3+，从而使紫红色络合物发生褪色反应，植酸含量与溶液褪色程度呈正比。

Carneiro等[13]利用测铁法结合自制的泵流动系统，测定了植物样品中植酸的含量，该方法测定线性范围在5～100 mg/L之间（对应吸光度范围在0.45～0.04之间），线性系数在0.999以上，最低检出限浓度为1.0 mg/L，精密度RSD＜1%。其他研究者[14-15]同样利用测铁分光光度法测定了大豆、麦麸、小麦等样品中植酸的含量，该法最大的优点是不需要昂贵的仪器，操作简单易行。

Agostinho等[16]利用碱性条件下2-羟基苯胺（GBHA）与钙离子形成紫红色络合物，植酸通过螯合钙离子抑制该反应，建立了一种简单、灵敏的植酸测定方法。该方法得线性范围在1.0～12.5 mg/L之间，线性系数为0.998 1，检测限为0.33 mg/L。该方法可用于测定玉米、大豆、小麦、面粉、燕麦等样品的植酸含量。为了进一步拓展应用领域，采用该方法对美白护肤霜中植酸含量进行测定，其回收率在86%以上。该方法用途广泛，精密度、准确度和检测限与文献报道的其他方法相当或者更好。

Kim等[17]用[Zn3（1,3,5-三[二（吡啶-2-甲基）氨基甲基]-2,4,6-三乙基苯]]6+作为植酸受体，结合金纳米粒子技术，开发了一个基于竞争的比色传感系统，该检测系统对植酸有很高的选择性，比比色探针的检测范围要高100倍以上，肉眼在小于300 nm处可以很容易地检测到植酸，并且在很宽的pH范围内工作良好，同时保证了高灵敏度。该方法还具有所需仪器简单、操作简便、便于观察等优点。

2.1.2 分子荧光法

Chen等[18]利用植酸、1,10-邻菲咯啉和Fe3+三元络合物形成的荧光物质，测定了食品中的植酸含量。该方法的线性系数为0.999 4，线性范围在0.33～32 mg/L之间，测定植酸含量4.62～24.08 mg/g的样品，其加标回收率在92.2%～98.3%之间。该方法简单、灵敏，但选择性有待提高，它为植酸的定量测定提供了新的思路。

2.1.3 高效液相色谱法

1980年Tangendjaja首次将高效液相色谱法运用于植酸测定[1]。Burbano等[19]采用高效液相色谱法示差折光检测器对豆类中的植酸及低磷酸肌醇进行了分离和定量测定，样品前处理采用了阴离子交换树脂纯化，在C18反相色谱柱上进行分离分析。该法测定植酸对实验前处理的要求比较高，包括色谱柱的选择、洗脱液的流速和洗脱条件，其灵敏度相对比较低。

Dost等[20]采用高效液相色谱法紫外检测器测定了小麦及其制品中的植酸含量。该方法是利用植酸对Fe3+-硫氰酸盐有色络合物的置换反应，利用高效液相色谱分离并监测有色络合物浓度的降低。硫氰酸根峰的保留时间小于3 min，方法线性范围在10～125 μg/mL之间，线性系数为0.997，方法检测限为0.5 μg/mL。该方法重现性好，准确度高。Dost等[21]采用该法又测定了茶和坚果类产品中的植酸含量，方法的线性范围在1～150 mg/L之间，线性系数为0.993 8。果仁的测定结果在1.54～9.74 mg/g之间，绿茶的植酸含量在27.67～28.82 mg/g之间，袋装茶的植酸含量在20.49～21.96 mg/g之间。该方法具有重现性好、准确度高等优点，可用于坚果、茶叶及其制品中植酸的常规分析。

2.1.4 离子色谱法

Talamond等[22]运用离子色谱法分析了小米和豇豆的植酸含量，该方法的测定范围在0.01～0.016 mmol/L之间，重复性RSD为5%（n=6），回收率为99%。同时与测铁比色法进行比较，结果发现比色法比该法的结果高出27%。运用该法测定谷物、油料种子、豆类的植酸含量，该法可以直接用于样品分析，前处理更简单，无需预纯化，分析速度快，比比色法结果更为准确。

Chen[23]利用离子色谱测定了豆类中的植酸和五磷酸肌醇的含量，样品用0.5 mol/L的盐酸提取，固相萃取柱净化后上机。植酸测定的线性范围在8.3～1 250 μmol/L之间，线性系数为0.999 7，回收率在94.8%～98.9%之间，检出限为1.5 μmol/L。该方法将植酸与低磷酸肌醇分离，消除了低磷酸肌醇的干扰，定量更准确。

陆智辉等[24]利用离子色谱法测定了棉仁样品中的植酸含量，棉仁粉样品烘干后用乙醚脱脂，稀HCl沸水浴提取，上清液纯化后上样分析。该方法的线性系数为0.999，平均回收率在98.64%～102.31%之间，检出限为0.059 μg/mL，定量限为0.196 μg/mL。该方法准确度高、重现性好，缺点是方法前处理时间比较长。

2.1.5 电泳法

Kvasnicka等[25]采用毛细管等速电泳法对大麦及其产品中的植酸及低磷酸肌醇进行了分离测定，样品在25 min内完成分离测定。该方法的优点是分析速度快、实验成本低。

2.1.6 质谱法

Zhang等[26]运用高效液相色谱串联质谱/质谱同时快速分离测定肌醇磷酸盐（InsPn），利用乙酸二己铵作为离子对试剂分离肌醇磷酸盐。该方法可以在15 min内分离测定InsP1～InsP6，线性范围在0.3～1 200 pmol之间，最低检出限为0.3 pmol（其中InsP2为0.15 pmol，InsP6为3 pmol），回收率在87%～111%之间，日内相对标准偏差（δRSD）为0.9%～15%，日间相对标准偏差（δRSD）为2.2%～11%。该方法分析速度快，灵敏度高，同时可分离低磷酸肌醇，定量更准确。

2.2 间接测定法

2.2.1 滴定法

原始的滴定法原理是利用植酸在低pH下，可以定量沉淀三价铁，根据沉淀前后铁含量的差异来确定样品中植酸的含量。然而由于三价铁和植酸的吸附量比例不是一个固定值，不同条件下变化比较大，故该方法不够准确。间接滴定法是通过定量的三价铁和适当的配体形成有色中间络合物，植酸竞争性结合三价铁，多余的三价铁通过EDTA滴定测定，间接计算样品中植酸的含量。这个中间络合物也就是金属指示剂，常用的有硫氰酸铵、水杨酸、水杨酸钠、磺基水杨酸，其中磺基水杨酸最为常用。

Burgos-Lujan等[10]测定了果汁和牛奶中植酸的含量，10 mL样品加入10 mL 0.4 mol/L稀盐酸、10 mL 20 mmoL/L的FeCl3·6H2O溶液、10 mL 200 g/L的磺基水杨酸溶液，混合振摇，沸水浴加热15 min，促进植酸-铁复合物的生成，离心后过滤，滤液用甘氨酸调整pH至2.5±0.5，运用EDTA溶液滴定滤液，溶液从紫色变为黄色，即为滴定终点。该方法测定线性范围在10～700 mg/L之间，线性系数为0.998，检测限为12 mg/L。该方法不能用于痕量分析。Romero-Aguilera等[12]开发了一种基于络合滴定原理测定植酸的方法，结果用植酸当量（PAE）来表示，其反映了样品中植酸的络合能力。方法的线性范围在0.5～57 mg植酸之间，线性系数为0.998 6，最低检出限浓度为0.02 mg PAE/100 g样品，最低定量限为0.789 mg PAE/100 g样品。该方法的日内相对标准偏差（δRSD）为2%，日间相对标准偏差（δRSD）为4%。20 mg和40 mg植酸的添加回收率在92%～105%之间。该方法考虑到低磷酸肌醇的存在，提出了植酸当量的概念，不需要昂贵的仪器，方法具有良好的准确度和精密度，适用于常规实验室检测。

2.2.2 分光光度法

植酸的分光光度间接测定法常用的是测磷法。该法主要是通过阴离子树脂分离样品中的植酸，然后通过酸水解消化释放植酸中的无机磷，最后通过测定磷含量来计算植酸含量。

仲磊等[27]运用稀盐酸提取发芽大豆的植酸，DEAE Sepharose FF阴离子交换树脂纯化提取液，对纯化溶液进行高温消化释放出无机磷，最后用钼蓝比色法测定植酸中的磷含量，根据磷和植酸的转换系数计算出样品中植酸含量。该方法的线性相关系数为0.999，加标回收率为108.4%，精密度δRSD＜5%。植酸测磷法的缺点是样品纯化和消化步骤花费时间比较长，不适用于大批量样品测定。

2.2.3 电感耦合等离子体发射光谱法

因为膳食中的植酸经人体吸收后，可以从尿液中排出，在预防肾结石方面有重要的作用。Grases等[28]利用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP）分析了尿液中的植酸含量，样品通过阴离子交换柱吸附分离植酸，分离后的样品通过电感耦合等离子体发射光谱仪测定磷的含量，从而推算出植酸含量。该方法的线性范围在0～2 mg/L磷之间（0～7 mg/L植酸），检出限为64 μg/L，定量限为213 μg/L。该方法简便快捷，适用于普通临床实验室常规尿中植酸含量的测定。

2.2.4 质谱法

为了验证组织中钙盐的结晶与植酸之间的关系，从而验证植酸预防肾结石的作用，March等[29]采用气相色谱串联质谱对生物样本（大鼠器官、人血浆、尿液等）的植酸含量进行了检测，利用酶法将生物样本中的植酸水解成肌醇，与衍生剂衍生后形成挥发性三烷基硅，通过气相色谱质谱法进行定性定量测定。该方法的线性范围在18～500 μg/L之间，最低检出限质量浓度为9 μg/L。该法前处理过程比较复杂，目前只用于生物样本的检测。

Munoz等[30]运用电感耦合等离子体质谱（ICPMS）测定了人尿中的总磷含量，间接计算出植酸含量，对尿液样本进行简单过滤，使用阴离子固相萃取柱纯化，除去其他磷化物的干扰。该方法的线性范围在0.02～0.06 mg/L植酸之间，方法检出限为5 μg/L植酸含量。该方法简单，消耗样品量小，样品测定速度快，是目前尿中植酸含量测定的最佳方法。

3 结语与展望

传统的植酸定量检测方法主要分为两大类：测磷法和测铁法。测磷法是将植酸提取转化成磷，通过测磷的含量间接计算出植酸的含量；测铁法是利用植酸/植酸盐能与三价铁定量络合，可以直接或者间接测量植酸的含量。随着研究的深入，科学家发现加工食品中低级肌醇磷酸盐的含量比较高，但是运用传统方法测定加工食品中的植酸含量时，很难将肌醇六磷酸盐与较低取代基的肌醇磷酸盐（InsP5、InsP4、InsP3等）分离开来，结果不够准确，容易使结果偏高。传统分析方法灵敏度低，分离低级肌醇磷酸盐的能力有限，因此有必要寻求更精确的替代方法，如高效液相色谱法、离子色谱法、质谱法等，但是这些方法需要贵重的仪器设备、复杂的前处理过程，会导致植酸的降解，对于未加工的食品是否同样适用，这些都是需要深入探讨的问题。

根据应用领域的不同，所介绍的方法各有优缺点，但理想的方法尚未达成一致。样品的前处理过程长短导致的植酸盐的分解、样品的种类差异导致的肌醇磷酸盐种类的差异等都是未来方法需要重点关注的问题。