猴头菌分子生物学研究进展*

张亚光，范明松，高 崎**

（1.上海上药杏灵科技药业股份有限公司，上海 201703；2.上海雷允上药业有限公司，上海 200336）

猴头菌[Hericium erinaceus（Bull.ex Fr.）Pers.]，俗称猴头、猴头菇、阴阳菇、猴菜、刺猬菌等，为担子菌门 （Basidiomycota） 伞菌纲 （Agariomycetes）红菇目 （Russulaemetica） 猴头菌科 （Hericiaceae）的大型食用菌，属腐木类真菌[1]，广泛分布于我国河北、内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁、广西、四川、云南、湖南等地[2]。栽培历史悠久，种质资源多样，年产经济价值达30亿元人民币[3]。猴头菌食药兼用，营养价值高；子实体内含抗氧化、免疫调节、抗癌的物质，长期食用可助消化、利脾胃[4]。猴头菌味甘性平，对各类常见的慢性胃炎、胃溃疡、胃癌和溃疡性结肠炎等疾病有一定抑制作用，研究表明发挥该作用的主要活性成分为多糖，可能通过调节SOD酶的变化，降低氧化损伤，发挥抑制胃炎和溃疡性结肠炎的作用，通过影响胃癌细胞凋亡、迁移和增殖抑制胃癌[5-6]。此外有研究者发现猴头菌提取物对引起胃病的幽门螺旋杆菌有一定抑制作用[7]。目前国内临床常用猴头菌复方制剂或联合疗法，治疗慢性胃炎、消化道溃疡、复发性口疮等[8-9]。当前以猴头菌菌丝体为原料，已开发出猴头菌片、猴头菇口服液等产品，未来在临床上应用前景广阔。

猴头菌分子生物学研究起步相比我国其他常见大型食用菌较晚。近年来，由于其保健功效和高营养价值，相关研究已经从亚洲局部地区扩展到全世界范围。研究者通过分子生物学手段全面开展了猴头菌基因组、转录组、次生代谢物等方面研究，其分子生物学研究也取得了较快速进展[4，10]。分子生物学技术全面引入为揭示猴头菌系统发育进化关系、基源鉴定、种质资源开发、代谢调控机制以及育种和菌种保护等研究提供了分子基础。现已开展了一定数量的探索不同种类以及不同时期猴头菌中功能化合物分离鉴定的研究，其中一些功能化合物和相关联基因深度开发极具前景[11]。作者将从猴头菌分子标记、种质资源的遗传多样性和功能基因等方面研究成果开展综述，以期为该领域的深入研究提供参考。

1 猴头菌遗传物质

1.1 基因组学研究

基因组学技术的进步，为药用真菌快速鉴定提供了新途径，其中大多数以DNA同源性为分析基础。通过将相同表现型的菌株在基因水平上开展鉴定，将猴头菌的鉴定技术引入分子时代。猴头菌的全基因组数据量与其他常见的大型食用菌的基因组数据量相比较大[12，14]，检测工作开展相对困难。通过分析其全基因组数据以及差异，全面呈现出猴头菌的遗传多样性和亲缘关系。张琪等[13]优化了猴头菌原生质体的制备条件，结合荧光染色以及分子鉴定获得了高纯度的单核体，为进一步开展猴头菌基因组水平的研究提供了材料和基础。陈娟等[14]首次报道了猴头菇的基因组序列，通过采用MPS技术获得了大小为39.35 Mb的基因组序列，编码蛋白的基因平均序列长度为1 345 bp。龚文斌等[12]完成了猴头菌单核体更加精确的全长测序和基因组组装，生成的基因组大小为41.2 Mb，累积编码了10 620个蛋白编码基因。这些研究为猴头菌系统进化分析和基因组水平的重建提供了重要数据。

1.2 转录组学研究

近年来，对猴头菌作为功能食品的需求日益增长引起了研究者的高度关注，针对不同的研究目的，目前已经有一定数量的猴头菌相关转录组学的报道。除了用于分子标记挖掘，该技术还可用于转录差异表达、功能基因的克隆和机理研究。陈娟等[14-15]最先研究了猴头菌单核细胞菌丝、双核的菌丝体和子实体转录组基因表达的差异，并比较了3个时期的高表达的基因，验证了猴头菌不同时期下活性化合物的生物合成与基因表达的关联性。朱伶俐等[16]通过对4个生长发育阶段猴头菌子实体进行转录组测序后，分析得出不同时期差异基因。龚文斌等[14]在猴头菌中发现了多种碳水化合物活性酶，共鉴定出447个转录因子共同参与木质纤维素降解的相关过程，与碳代谢过程相关联。

随着分子生物学技术的广泛运用，植物基因克隆、转录组测序技术越来越多的应用到真菌的次生代谢物研究中[17]。目前猴头菌属真菌活性次级代谢产物的研究已经比较深入，已发现了83种不同类型的活性次级代谢产物，主要包含脂肪酸、生物碱类化合物、萜类化合物、酚类化合物等，这些成分显示了抗肿瘤、保肝护胃、降血糖、保护神经、抗癌、抗衰老、抗氧化等多种生物学功能[18]。张静等[19-20]详细介绍了猴头菇活性成分及其功能性的研究进展，但就目前而言，有关猴头菌转录组学研究方面内容缺乏，且不够系统。刘高强等[21]通过14C标记示踪技术，分析测定了葡萄糖的代谢流动，已经构建出灵芝内多糖的合成基本途径，虽然还不完善，但是为研究猴头菌多糖合成相关关键基因和关键酶提供了借鉴。张楠等[22]通过新一代RNA测序技术获得了6株猴头菌的转录组，并研究了转录组的特征和生物活性化合物特别是多糖的生物合成，有助于研究猴头菌中多糖的生物合成过程，为探索猴头菌以及担子菌门（Basidiomycota）其他成员的次生代谢物的相关基因提供有用的信息。猴头菌多糖的生物合成途径相对复杂，相关研究将成为未来猴头菌多糖研究的最具潜力的方向。此外，陈娟等[14]检测到在萜类骨架、二萜类、倍半萜类和多酮类生物合成过程中，有多种酶和大量的细胞色素P450蛋白参与，并通过基因组和转录分析揭示了猴头菇中不同萜烯类和多酮类次生代谢物相关基因的调控差异。

1.3 功能基因定位

研究猴头菌的功能基因是展示猴头菌菌丝生长和代谢调控机制的重要途径，也是优良新种育种和基因功能分析的相关方法。其中，猴头菌的大多数重要农艺性状如菌丝生长速度、酶活性以及产量等都是数量性状，是由多个数量基因座位和外在环境因素共同控制的[23-24]。食用菌诱变育种均是以获得优良农艺性状为目标，常规方法难以实现数量性状遗传变异[25]。通过构建遗传连锁图谱，寻找与数量性状位点紧密连锁的分子标记是数量基因座位的研究方法[26]。朱伶俐等[27]通过研究猴头菌子实体4个生长发育时期后，筛选出最显著的20条参与碳代谢、淀粉代谢和蔗糖代谢通路的相关基因，分析得到不同时期下的差异基因，初步定位多糖合成功能基因。

2 猴头菌属分子鉴定

2.1 基于常规PCR的分子标记技术

采用PCR方法的扩增检测技术是药材基源鉴定的快速检测方法，其通过扩增条带差异进行分子鉴定，具有分辨率高且无需测序出DNA序列信息等优点。目前应用于猴头菌鉴定的分子标记主要有PFLP技术、RAPD技术、SRAP技术、IRAP技术和ISSR技术等。

PFLP技术是一种通过PCR技术扩增出一段特定的目标靶向片段后，继而采用限制性内切酶统一处理的分子标记技术[28-29]，可以较为简便、迅速的区分出不同的物种，属于第一代分子标记[30-31]。曹鸿雁等[32]利用ITS序列及ITS-RFLP分析，分别对福建省食用菌种质资源库保藏的猴头菇及灰树花、滑菇、黄伞、桑黄、姬松茸、虫草、黑木耳和毛木耳8个近品进行了准确的鉴定分类，初步形成了各相关物种的鉴别方法。

RAPD是使用一段较短的随机寡核苷酸序列引物扩增基因组的检测技术，与RFLP技术类似，是第二代分子标记，可用于快速鉴定真核生物[33-34]。宋慧[35]采用该技术检测各菌株基因组DNA在这些区域的多态性。Liu等[36]以猴头菌液体和固体培养物为原料，证明采用RAPD和PCR技术结合的方式可以很好地筛选和鉴定猴头菌的菌株。

SRAP分子标记技术即相关序列扩增多态性分子标记技术，具有重复性好、简单操作、费用低廉等优点，该技术主要是对基因的编码区进行扩增，定向分析基因的功能序列[37]。SRAP以其独特的引物设计在基因组学上广泛应用于分子遗传图谱的构建以及基因定位等方面[38-39]。刘麒等[40]建立了猴头菌菌丝体基因组DNA的高效提取方法和SRAP标记体系，并利用SRAP标记对17个猴头菌菌株进行了亲缘关系分析和菌株鉴定，为菌株资源的鉴定、利用提供一定的研究基础。

IRAP作为新型DNA分子标记技术，具有便捷、稳定扩增目标条带的特点[36-37]。王俊等[10]分析了30余种栽培猴头菌菌株种间遗传差异，为猴头菌道地性研究、种质资源鉴定、亲缘关系研究和引种栽培提供了分子生物学依据。结果表明，34个猴头菌菌株间均有遗传上的差异，但遗传相关性极高，同时表明我国猴头菌栽培菌株间的遗传背景较单一。

ISSR是在SSR技术原理上建立起来的一种分子标记技术，可以很好地反应出检测物种的遗传多样性[38-39]。可用于快速实现对不同基源或不同基因类型猴头菌的准确鉴定。杨爽[40]分析了65株猴头菌的遗传多样性，结果显示各个菌株在图谱上都存在较强的特异性，所选用8个ISSR引物能将所有供试菌株相互区分开，并表现出丰富的遗传多样性。

2.2 DNA条形码鉴定

随着DNA条形码体系的建立，常见真核生物的鉴定逐渐迈入基因鉴定时代。DNA条形码鉴定技术是一种采用一段序列长度适宜、公认标准的DNA序列用于物种间鉴别的方法。DNA条形码的特征常包含具有适当数目的特异性单核苷酸变异信息位点，实现对不同物种达到足够的区分度[41-42]。通过运用这种简单、易推广的方法来鉴定物种以实现数据信息化最终达到资源共享，高效、准确鉴别物种的目的[43]。Chen等[44]提出ITS和ITS2均可作为植物和真菌的核心条形码。王盼盼等[45]通过DNA条形码技术，对所采集的包含猴头菇在内的74种常见大型真菌进行了种属水平的物种多样性鉴定，将其鉴定为36属、18科、6目、3纲，丰富了我国真菌的条形码基因库。皇甫永冠等[46]应用分子生物学方法进一步构建猴头菇品种专属的DNA条形码，研究结果表明，该方法可以准确进行猴头菌种间鉴定。基于条形码构建系统发育进化树的方法有多种，王俊等[10]分析表明，我国自然条件下采集得到的猴头菌分3个种，即猴头菌 （Hericium erinaceus）、珊瑚状猴头菌（Hericium coralloides） 和冷杉猴头菌（Hericium abietis），其中猴头菌与冷杉猴头菌相互亲缘关系较近，可有效区分猴头菌菌种。

当前几种运用于猴头菌的分子鉴定方法各有优点和局限。各方法间的相互比较详见表1。

表1 几种分子鉴定方法的比较Tab.1 Comparison of several identification methods

3 展望

猴头菌食药兼用，是高营养价值的美味食用菌[52]。针对猴头菌部分次生代谢物的生物活性及其种质资源多样性已经进行了大量研究工作，如生物碱和多糖类具有多种生理活性，保健、抗肿瘤、调节免疫等。但研究的系统性仍然不足，特别是目前猴头菇药用成分与对应的调控基因之间的关联还不清楚，对猴头菌生长发育和药用成分的决定性作用部位和研究机理尚不清楚，子实体和菌丝体品质控制难等问题，这极大地限制了猴头菌的深度开发和利用[53-54]。分子生物学技术和功能基因的测序、复制以及定位技术的研究将对其有关品种的准确识别、产品的深度开发和相关种质资源多样性研究注入新的活力[55]。

未来在猴头菌的分子生物学研究方面，可进一步深入开展测序工作，将基因组、转录组、蛋白组和关键农艺性状指标或药学成分指标检测相结合，基于跨组学整合策略开展猴头菌活性成分累积机制研究及潜在调控元件筛选，挖掘出与关键农艺性状或药学成分指标相关的功能基因，为培育获得高目标活性成分含量的猴头菌菌株奠定理论基础；探究不同生长阶段猴头菌的培养条件、药用部位的异同，以及药用成分的表达情况，测定代谢组以确定不同生长阶段猴头菌代谢物的种类及含量差异；通过分子标记技术，开展猴头菌遗传多样性研究，确立可靠的形态分类特征与适合的DNA条形码片段，对现有品种进行定型，为大型产业应用提供技术保障、为猴头菌真菌资源的保护和利用提供科学依据；结合化学方法和物理手段，构建诱变育种相关方法，进行种质改良[56]；最后是菌丝体以及子实体不同生长时期猴头菌多糖、多肽、生物碱、脂肪酸等药用成分的表达和质量标志物成分的检测以及对主要成分开发应用等方面开展综合研究。