褐藻素通过NF-κB信号通路在体内、外对自发性糖尿病相关性糖尿病肾病保护作用机制的研究

刘营营 聂明豪 袁颖 杨彬 王岩

【摘要】 目的：研究褐藻素对自发性糖尿病相关性糖尿病肾病（DN）的治疗作用。方法：Goto-Kakizaki（GK）大鼠自由食用含或不含褐藻素的标准饲料13周，Wistar大鼠作为对照。褐藻素对分离的大鼠肾小球系膜细胞（GMC）无细胞毒性。用血糖仪测定空腹血糖水平，用全自动生化分析仪测定尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr）水平，用ELISA试剂盒测定尿蛋白水平。用ELISA试剂盒检测肾皮质胶原Ⅳ水平，Western blot法检测肾皮质和肾小球系膜细胞转化生长因子-β1（TGF-β1）、纤维连接蛋白（FN）和肾小球系膜细胞核因子-κB（NF-κB）的表达水平。结果：糖尿病组空腹血糖、尿素氮、血肌酐、尿蛋白水平均较对照组、糖尿病+褐藻素组显著升高（P<0.01）;糖尿病组肾皮质胶原Ⅳ、TGF-β1和FN的表达及肾小球系膜细胞TGF-β1和FN均较对照组、糖尿病+褐藻素组显著升高（P<0.01）;糖尿病组NF-κB p65表达明显高于对照组与糖尿病+褐藻素组（P<0.01）。结论：褐藻素通过减弱NF-κB信号通路的激活，降低高血糖，预防或阻止与自发性糖尿病相关性DN的发展。

【关键词】 褐藻素 NF-κB 自发性糖尿病相关性糖尿病肾病

[Abstract] Objective： To study the therapeutic effect of Fucoidan on spontaneous diabetes-associated diabetic nephropathy （DN）. Method： Goto-Kakizaki （GK） rats were allowed free access to standard rat food with or without fucoidan for 13 weeks， and Wistar rats were selected as controls. Fucoidan did not show any cytotoxicity on glomerular mesangial cells （GMCs） which separated from rat kidneys. Fasting blood glucose levels were measured by blood glucose meter， blood urea nitrogen （BUN） and serum creatinine （Cr） levels were measured by automatic biochemistry analyzer and urine protein levels were measured by ELISA kit. Collagen Ⅳ levels in the renal cortex were measured by ELISA kit， and the expression levels of transforming growth factor-β1 （TGF-β1） and fibronectin （FN） in the renal cortex and GMCs， and nuclear factor-κB （NF-κB） in GMCs were determined by Western blot. Result： The levels of fasting blood glucose， BUN， serum Cr and urine protein in diabetic group were significantly higher than those in the control group and diabetic + Fucoidin group （P<0.01）. The expression of collagen Ⅳ， TGF-β1 and FN in renal cortex and the expression of TGF-β1 and FN in glomerular mesangial cells in diabetic group were significantly higher than those in the control group and diabetic + Fucoidin group （P<0.01）. The expression of NF-κB p65 in diabetic group was significantly higher than those in the control group and diabetic + Fucoidin group （P<0.01）. Conclusion： Fucoidan reduces hyperglycemia and prevents or impedes the development of spontaneous diabetes-related DN by attenuating the activation of NF-κB signaling pathway.

[Key words] Fucoidin NF-κB Spontaneous diabetes-related diabetic nephropathy

First-authors address： Heilongjiang Provincial Hospital， Harbin 150000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.03.006

糖尿病腎病（DN）是糖尿病最严重的微血管并发症之一，也是终末期肾功能衰竭的主要原因[1]。TGF-β1的表达水平升高已被认为是DN的标志。核因子-κB（NF-κB）是一种转录因子，通常情况下，通过与抑制蛋白IκB的相互作用，以非活性形式被隔离在细胞质中。在糖尿病条件下，激活的NF-κB移位到细胞核，并触发其目标基因的表达，包括TGF-β1和FN，进一步导致细胞外基质的积累[2]。褐藻素（Fucoidan）是一种海藻提取物，作为一种抗氧化剂、抗癌和抗炎剂已被广泛研究，并已被证明在癌症和炎症中发挥重要作用[3-4]。因此，笔者预期通过本研究，确定褐藻素是否能抑制自发性糖尿病相关性DN的发展。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 实验在哈尔滨医科大学动物实验中心进行，并经哈尔滨医科大学伦理中心批准。雄性Goto-Kakizaki（GK）大鼠和Wistar大鼠均购自CLEA，Japan。大鼠被安置在可控制的环境中，温度为（24±1）℃，每天早上7点开灯，光照12 h。在6周龄时，大鼠被允许自由获得标准的大鼠食物和水，以及含或不含有推荐浓度的褐藻素（购自Sigma-Aldrich公司，上海，中国;剂量为75 mg/kg），喂养13周。其中分为对照组（Wistar大鼠）与糖尿病组（GK大鼠）、糖尿病+褐藻素组[褐藻素75 mg/kg，GK大鼠]，每组8只大鼠。

1.2 细胞培养 大鼠肾小球系膜细胞（GMC），从GK大鼠和Wistar大鼠的新鲜肾小球中分离出来，通过原代培养的过滤和筛选，并经过特定的筛网尺寸（200、100和80 ?m）迭代选择来获取。收集留在筛子上的GMC，用1 000 r/min离心洗涤5 min，用250 U/mLⅠ型胶原酶在37 ℃孵育30 min。GMC保存在20%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素（Sigma-Aldrich）的DMEM培养基中，温箱条件为37 ℃（三洋），二氧化碳浓度为5%。培养液为DMEM+20%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素（Sigma-Aldrich）。

1.3 细胞毒性实验 CellTiter 96?水溶液细胞增殖试验（试剂购于Promega，Madison，WI，USA），是已被报道的测定细胞毒性和活细胞数的有效方法，用来测定褐藻素的细胞毒性。大鼠肾小球系膜细胞以2×104个/孔的浓度接种，接种于96孔板中，培养条件为37 ℃，5%CO2培养2 d。用不同浓度的褐藻素（0、10、50、100、500和1 000 ?g/mL）处理系膜细胞，然后继续孵育24 h。随后，将20 ?L的CellTiter 96?水溶液细胞增殖试验溶液加到96孔板中，继续孵育1 h，使用MTP-800微板读取器（购于Corona Electric Co.Ltd.Ibaraki，Japan），测量490 nm处的吸光度。

1.4 空腹血糖、尿素氮、血肌酐和尿蛋白水平测定 血糖仪（OneTouch UltraEasy，Edina，MN，USA）测量空腹血糖，ELISA试剂盒（R&D Systems， Minneapolis，MN，USA）测量24 h尿白蛋白水平，自动生化分析仪（Olympus-2000，Olympus，Tokyo，Japan）测定尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr）水平。

1.5 Western blot分析 使用具有12%聚丙烯酰胺含量的垂直平板凝胶进行电泳。蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶向膜的转移是根据参考文献提供的方法[5]，并经过一定的修改，在电流为15 A的半干电吸墨仪（Sartorius AG，Goettingen，Germany）电泳90 min。用Ace?（4%）阻断膜在22 ℃作用30 min，用兔抗TGF-β1（SAB4502954）、FN（AV41490）和NF-κB（SAB4502610）抗体进行第一反应;在相同的缓冲液中洗涤后，用辣根过氧化物酶标记的兔抗IgG（20 ng/mL）在22 ℃下反应30 min。洗涤结束后，使用通用电气生命科学公司（购自GE Healthcare Life Sciences，日本东京）的ECL Plus Western blotting检测系统?（GE Healthcare Life Sciences，Tokyo，Japan）对膜进行增强化学发光反应。

1.6 胶原Ⅳ水平测定 使用匀浆机（UH-50，SMT Co.，Ltd.，Tokyo，Japan）將肾组织切碎，用10%磷酸盐缓冲液（PBS，0.1 mol/L，pH值7.4）制备匀浆。肾匀浆在4 ℃下15 000 r/min离心15 min，收集上清液，使用ELISA试剂盒（R&D系统）测定肾皮质Ⅳ型胶原的含量。

1.7 组织病理 将GK大鼠和Wistar大鼠的肾脏固定在10%中性缓冲福尔马林中，然后石蜡包埋。石蜡包埋组织切片（4 ?m厚）用苏木精伊红（H&E）溶液染色[6]。在镜下观察，使用光学显微镜（Olympus BX-50，Olympus Optical，Tokyo，Japan）将肾小球最大直径的横截面拍摄并转换为数字图像。

1.8 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM） 将GK和Wistar大鼠肾脏中的GMC接种在玻片上。GMC用PBS洗涤，4%多聚甲醛固定，并在PBS中放置20 min，室温下用0.1% Triton X-100渗透5 min。进一步洗涤后，用10%的山羊血清在室温下封闭细胞30 min。然后将细胞与鼠抗p65（稀释度1︰100）抗体（sc-8008;Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas，TX，USA）在室温下孵育2 h，然后与二抗（Alexa Fluor?488耦联的山羊抗鼠IgG，稀释度1︰1 000）孵育（A-11029，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）孵育1 h。细胞核用Hoechst 33342溶液（5 ?g/mL磷酸盐缓冲液）复染10 min。使用防脱玻璃片（Invitgen），用Carl Zeiss LSM 710激光共聚焦荧光显微镜获取图像（Carl Zeiss AG，Jena，Germany）。

1.9 统计学处理 采用SPSS 10.0软件对所得数据进行统计分析，每个实验至少重复3次。计量资料用（x±s）表示，比较采用Students t-test检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 褐藻素对肾小球系膜细胞的作用 海藻、墨角藻的提取物——褐藻素的结构（图1A），褐藻素对系膜细胞没有明显的细胞毒作用（图1B）。

2.2 褐藻素对大鼠空腹血糖、尿素氮、血肌酐和尿蛋白水平的影响 糖尿病组空腹血糖、尿素氮、血肌酐和尿蛋白水平均较对照组、糖尿病+褐藻素组显著升高（P<0.01），见图2与表1。

2.3 褐藻素对大鼠肾皮质Ⅳ型胶原表达水平的影响 糖尿病组肾皮质TGF-β1、FN和胶原Ⅳ表达水平及肾小球系膜细胞（GMC）TGF-β1和FN表达水平均显著高于对照组与糖尿病+褐藻素组（P<0.01）。糖尿病组肾皮质胶原Ⅳ含量明显高于对照组（P<0.01）。在肾小球系膜细胞体外实验中也观察到了类似的结果，糖尿病组肾小球系膜细胞表达TGF-β1和FN水平均较对照组增高（P<0.01）。然而，在糖尿病+褐藻素组肾小球系膜细胞中，这些指标水平降低。见图3与表2。

2.4 褐藻糖对GK大鼠肾脏组织病理学改变的作

用 糖尿病组与对照组相比，肾小管上皮细胞空泡化、再生，肾间质炎症细胞浸润明显。褐藻素显著减轻GK大鼠肾脏的组织病理学改变。糖尿病组与对照组相比，肾小管上皮细胞空泡化、再生，肾间质炎症细胞浸润明显。褐藻素可明显减轻GK大鼠肾脏的组织病理学改变。糖尿病组肾小球系膜细胞NF-κB p65核转位增加。褐藻素显著减弱NF-κB p65在系膜细胞中的核转位。见图4。

2.5 褐藻素对肾小球系膜细胞NF-κB p65核转位的作用 NF-κB p65的表达，对照组、糖尿病组、糖尿病+褐藻素组分别为（100.0±2.6）、（224.7±23.8）、（134.6±18.9），糖尿病组NF-κB p65表达明显高于对照组与糖尿病+褐藻素组，差异均有统计学意义（P<0.01），见图5。

3 讨论

DN是糖尿病最严重的微血管并發症之一，也是终末期肾功能衰竭的主要原因[7]。早期DN以肾脏增大、肾小球肥大、肾小球高滤过和微量白蛋白尿为特征。这些改变与随后肾小球形态异常的发展和DN的预后有关[8]。炎症已成为DN的关键病理生理机制[9]。DN的特征性病理改变之一是肾小球和肾间质中ECM成分的积聚，包括胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白[10]。高血糖被认为是通过增加TGF-β1的表达促进DN的发生、发展。TGF-β1表达水平的升高被认为是DN的标志，TGF-β1是促进细胞外基质积聚的最主要生长因子[11]。本研究证实糖尿病组TGF-β1的表达与FN和Ⅳ型胶原水平均明显高于对照组（P<0.05）。这些因素加速了肾小球硬化和肾小管间质纤维化的发病[12]，增加了BUN、血Cr和尿蛋白水平。

本研究观察了褐藻素对自发性糖尿病相关性肾病的体内外治疗作用。褐藻素对分离的Wistar大鼠肾小球系膜细胞无明显的细胞毒作用。糖尿病+褐藻素组空腹血糖、BUN、血Cr和尿蛋白水平均显著降低，肾皮质和肾小球系膜细胞TGF-β1和FN表达水平明显降低（图2、3）。这与贾英丽等[11]的研究中给予小鼠腹腔注射褐藻多糖后，小鼠肾功能得到改善，血肌酐浓度下降34%，尿素氮水平下降25%，24 h尿白蛋白排泄量下降41%一致。组织病理学分析还显示，口服褐藻素可减轻GK大鼠肾脏组织病理改变，如肾小管上皮细胞空泡化和再生，以及肾间质炎症细胞浸润（图4）。朱小雨等[12]学者在研究中发现，高糖状态下TGF-β1的蛋白水平明显升高，但能够被褐藻素逆转，使用褐藻素干预后，其水平可明显减低，与本文研究结果一致，说明褐藻素可有效减低高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞的细胞外基质成分堆积，同时可改善细胞肥大现象，其机制与细胞内氧化应激反应减轻、炎症因子表达降低存在一定相关性，因此证实褐藻素可对糖尿病肾病发挥一定保护效应。NF-κB是一种核转录因子。NF-κB转录因子家族调控炎症活动。NF-κB调节许多基因的表达，这些基因在人类和实验性肾损伤的炎症反应中起关键作用。认为NF-κB活化和慢性炎症在DN的发病机制中起关键作用。在糖尿病条件下，随着IκB-α的磷酸化和降解，NF-κB p65移位到细胞核，并与特定的DNA序列结合激活靶基因的转录，包括TGF-β1和FN，导致细胞外基质聚积。为了更好地了解褐藻素在预防自发性糖尿病相关性糖尿病肾病（DN）发展中的作用机制，研究了NF-κB p65的核转位，结果显示，糖尿病+褐藻素组的肾小球系膜细胞NF-κB核转位增加和NF-κB p65表达明显减弱（图4、5），提示NF-κB信号通路在DN的发生、发展中起重要作用。由于高糖经过多元醇通道提升血流，从而促进肾小球高滤过、尿蛋白排泄率提升，同时减低纤维连接蛋白的降解，导致肾小管基膜增殖变厚。而转录NF-κB属于细胞存活因子，可降低NF-κB的核转录与受损的系膜细胞存活息息相关[13-16]。而高糖经过激活蛋白激酶C、诱导高糖代谢产生的反应性氧簇提升后，可进一步促进NF-κB活化，而NF-κB活化后使肾小球系膜细胞MCP-1mRNA表达、蛋白分泌增多，并对PKC进行阻断。高糖增强系膜细胞凋亡可能与NF-κB活性存在关联，且SN50能够抑制NF-κB活性，并模拟高糖增强凋亡的效应，因此证实高糖介导的NF-κB活性的抑制与凋亡细胞的提升与肾小球硬化存在一定相关性[17-18]。然而，褐藻素可减弱GK大鼠肾小球系膜细胞中NF-κB的核转位，但不能完全阻断，提示这一过程可能有其他机制参与[18-19]。其中涉及的复杂过程和机制需要进一步研究。

本研究首次在体外和体内测定了褐藻素对自发性糖尿病相关性DN的保护作用。本研究证明褐藻素通过抑制NF-κB信号通路的激活来预防、阻止与自发性糖尿病相关的DN的发展，因此褐藻素可能被认为是治疗DN的一种新的治疗药物。

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（收稿日期：2020-07-17） （本文编辑：程旭然）