miR-140靶向调控SOX2在结肠癌中的作用机制研究

2021-05-07 06:52王晓元赵轶峰杨永江黄迪苏卓彬李坤李晶晶李曙光
现代消化及介入诊疗 2021年3期
关键词:荧光素酶结果显示结肠癌

王晓元,赵轶峰,杨永江,黄迪,苏卓彬李坤,李晶晶,李曙光

结肠癌是起源于结直肠黏膜上皮的肿瘤,在过去几十年的治疗中取得了很大的进展,但总体生存时间和5年生存率并没有得到明显的改善[1-2]。结肠癌的发生是一个复杂的过程,因此研究结肠癌肿瘤发生的关键调控因子并探索其机制,寻找新的治疗方法以改善患者预后,具有重要意义[3-4]。微小 RNA(microRNAs,miRNAs)是由19~23个核苷酸组成的小型非编码RNA,是一类表观遗传调控因子,在基因表达谱的调节中发挥至关重要的作用[5-6]。大量研究证明,miRNAs作为基因表达重要的调节分子,在肿瘤的多个过程中具有重要的作用[7-8]。多种 miRNAs 已证实与结肠癌密切相关[9]。如miR-937在结肠癌中表达上调,而miR-143、miR-145在结肠癌中表达降低[10-11]。但miR-140在结肠癌中的功能尚鲜有报道。本研究旨在观察miR-140对结肠癌细胞生物学行为的调控作用,分析miR-140在结肠癌发生发展中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

收集本院74例经手术切除并病理确诊为结肠癌的手术患者肿瘤组织样本及正常癌旁组织标本,所有患者术前均未进行化学治疗。患者并签署知情同意书,研究获得本院伦理委员会批准。人正常结直肠黏膜细胞FHC与结肠癌细胞株SW480、HT29、HCT116购买自中国科学院上海细胞库。miR-140 模拟物阴性对照购买自上海吉玛基因。SOX2一抗(ab97959)、GAPDH抗体(ab9485)、Ki67抗体(ab15580)、IgG二抗(ab150077)购买自Abcam公司。转染试剂 LipofectamineTM2000购买自Invitrogen 公司。qRT-PCR试剂盒、DMEM培养基、胎牛血清、TRIzol® 试剂盒、反转录试剂盒、BCA 蛋白质分析试剂盒均购买自赛默飞世尔科技公司, CCK-8试剂盒购买自日本同仁公司。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养与转染 人正常结直肠黏膜细胞FHC与结肠癌细胞株SW480,HT29和HCT116用含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基,置于含5% CO2, 37 ℃的恒温箱中培养。将HT29细胞分为miR-NC组和 miR-140组,按照转染试剂LipofectamineTM2000 试剂说明书分别对细胞转染miR-NC 和miR-140 mimics,用于后续研究。

1.2.2 qRT-PCR检测结肠癌细胞/组织中miR-140/ SOX2表达 从结肠癌细胞系或组织中提取总RNA,紫外分光光度法测定RNA的含量,逆转录后进行PCR检测,miR-140的表达水平以U6为内参,SOX2的mRNA表达水平以GAPDH为内参,qRT-PCR结果以2-ΔΔCT值形式得到。

1.2.3 CCK8实验检测细胞增殖能力 HT29细胞按1×104个/孔接种于96孔板,每孔200 μL加入miR-NC组和 miR-140组细胞悬液,常规培养24 h后,参照CCK-8试剂盒操作说明书进行操作,用酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.2.4 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 将HT29细胞接种于6孔板上,当细胞汇合度达到80%~90%时,用200 μL的移液器枪头在正中央位置划一直线,形成单层细胞间的划痕,将细胞培养板置于显微镜下观察并拍照。

1.2.5 双荧光素酶报告基因实验检测miR-miR-140与SOX2的3′-UTR结合情况 利用TargetScan预测miR-140在SOX2的3′-UTR上具有潜在的结合位点。构建SOX2野生型3′-UTR荧光素酶报告基因质粒pMIR-SOX2-wt和突变型报告基因质粒pMIR-SOX2-Mut。将野生型或突变型质粒与miR-140 mimics共转染进HT29细胞,根据报告基因检测试剂盒说明书进行检测,使用双荧光素酶报告仪测定系统分析荧光素酶活性。

1.2.6 Western Blot检测细胞SOX2蛋白表达 采用RIPA裂解液提取结肠癌细胞或组织蛋白,BCA试剂盒测定蛋白浓度,加入缓冲液后变性蛋白。10% SDS-PAGE电泳分离蛋白,随后转到PVDF膜上,5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h。加入一抗SOX2抗体(1∶500)和GAPDH抗体(内参)(1∶1 000)。4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的兔二抗(1∶1 000),室温孵育1 h,ECL液暗室发光显影,采集图像并分析。

1.2.7 免疫组化检测结肠癌组织中SOX2表达 石蜡切片置于65 ℃烤箱中过夜,而后梯度脱蜡、水化。加入3% H2O2孵育15 min以阻断内源性过氧化物酶活性。切片置于柠檬酸盐缓冲液并采用微波加热法以修复抗原。加入5%的正常羊血清封闭,室温孵育15 min。加入一抗SOX2抗体(1∶100),Ki67抗体(1∶100),4 ℃过夜。加入辣根过氧化物酶标记的兔二抗(1∶200),37 ℃孵育30 min。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,37 ℃孵育30 min。采用DAB显色后,苏木精室温染色、脱水、中性树脂封片。

1.2.8 裸鼠成瘤实验 选用BALB/c裸鼠12只,4周龄左右,体质量13~17 g,于22 ℃恒温,40%~75%湿度条件下饲养。所有裸鼠随机分为对照组miR-NC组(n=6)和miR-140mimics组(n=6)。HT29细胞转染miR-NC或miR-140 mimics后,将细胞配置成浓度约为 1×107个/mL 单细胞悬液,每只裸鼠左前肢近腋窝处皮下接种0.2 mL细胞悬液。3周后采用颈椎脱臼法处死全部裸鼠,剥离瘤体,称重,拍照,甲醛固定。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 结肠癌组织和细胞中miR-140表达降低

qRT-PCR检测结果显示,miR-140在结肠癌组织相对表达量0.56±0.12,较癌旁正常组织(1.00±0.05)明显降低(P<0.01,图1A)。并且结肠癌细胞株SW480、HT29和HCT116中miR-140的相对表达量(0.65±0.11、0.25±0.04、0.79±0.05)相比人正常结直肠黏膜细胞FHC(1.00±0.03)不同程度降低(P<0.01,图1B)。

图1 结肠癌组织和细胞中miR-140表达变化 A:在结肠癌组织中miR-140的表达(与Normal比较,**P<0.01); B:在结肠癌细胞株中miR-140表达(与Normal比较,**P<0.01)

2.2 miR-140对结肠癌细胞增殖和迁移的影响

将miR-NC或miR-140 mimics转染进HT29细胞,qRT-PCR检测结果显示,miR-140mimics转染组中miR-140的相对表达量(8.98±0.13)明显高于miR-NC组(1.00±0.05),差异有统计学意义(P<0.01,图2A),表示转染成功。采用CCK8法检测两组细胞的增殖结果显示,相比miR-NC组,miR-140mimics组的OD值(450 nm)明显降低[(1.14±0.18)vs(0.67±0.12),P<0.01,图2B]。细胞划痕实验检测结果显示,12 h后miR-140 mimics组的细胞迁移率明显降低[(50.25±0.48) %vs(10.49±0.17) %,P<0.01,图2C]。

图2 miR-140对结肠癌细胞增殖和迁移的影响 A:miR-140转染成功; B:CCK8法检测细胞的增殖能力; C:细胞划痕实验检测细胞迁移能力(bar=25 μm, 400倍)。与miR-NC组比较,**P<0.01

2.3 SOX2是miR-140的靶基因

采用TargetScan分析结果显示(图3),miR-140在SOX2的3′-UTR上具有潜在的结合位点。双荧光素酶报告基因试验进一步进行验证,结果显示,相比共转染pMIR-SOX2-wt与miR-NC,将野生型pMIR-SOX2-wt质粒与miR-140mimics共转染进HT29细胞,荧光素酶活性明显降低[(12.14±1.18)vs(17.75±1.21),P<0.01];而相比共转染突变型报告基因质粒pMIR-SOX2-Mut与miR-NC,将pMIR-SOX2-Mut质粒与miR-140mimics共转染进HT29细胞,荧光素酶活性无明显变化(P>0.05,图3B)。这表明miR-140能特异性结合SOX2的3′-UTR。

2.4 miR-140对SOX2的调控

使用qRT-PCR和Western blot检测两组HT29细胞mRNA和蛋白表达变化,结果显示,相比miR-NC组, miR-140组SOX2 mRNA相对表达量明显降低[(1.01±0.04)vs(0.59±0.07),P<0.05,图4A],同时miR-140组 SOX2 蛋白相对表达量 明显降低[(1.00±0.08)vs(0.38±0.15),P<0.05,图4B]。

2.5 结肠癌细胞和组织中SOX2表达升高

结肠癌细胞株SW480、HT29和HCT116中 SOX2的mRNA相对表达量分别为(2.25±0.19)、(3.29±0.27)、(1.74±0.08),较FHC细胞相对表达量(1.00±0.05)均有不同程度升高(P<0.01,图5A),结肠癌组织中SOX2的mRNA相对表达量明显高于癌旁正常组织[(3.57±0.32)vs(1.00±0.03),P<0.01,图5B]。免疫组化检测结果也证实,SOX2蛋白在结肠癌组织中的表达与癌旁正常组织相比明显升高(图5C)。

图3 SOX2是miR-140的靶基因 A:miR-140和SOX2靶向关系预测; B:双荧光素酶报告基因试验检测荧光素酶活性(与pMIR-SOX2-Mat比较,**P<0.01)

2.6 miR-140和SOX2在结肠癌裸鼠移植瘤模型中的作用

HT29细胞转染miR-NC或miR-140 mimics后接种于裸鼠皮下构建结肠癌裸鼠移植瘤模型,21 d后剥离肿瘤,裸鼠成瘤情况,如图6A所示,miR-140组裸鼠的瘤体明显小于miR-NC组。采用免疫组化检测两组裸鼠肿瘤组织中SOX2和Ki67的表达,结果显示,相比miR-NC组,miR-140 mimics组中SOX2和Ki67的表达均明显降低(图6B)。提示miR-140过表达下调了SOX2的表达并抑制了结肠癌细胞的增殖。

图4 miR-140对SOX2的调控 A:miR-NC组和miR-140组中SOX2 mRNA表达; B:miR-NC组和 miR-140组中SOX2蛋白的表达(与miR-NC组比较,**P<0.05)

3 讨论

miR-140是具有抑癌作用的一类miRNA,研究发现, miR-140-5p可以通过下调GLUL对胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭有抑制作用[12]。Han[13]等发现过度表达miR-140可通过调控Smad3抑制非小细胞肺癌的侵袭和迁移。Lu[14]研究表明miR-140通过抑制FEN1从而抑制DNA损伤修复在乳腺癌中起到抑癌作用,并揭示miR-140是一种新的辅助治疗乳腺癌的抗肿瘤因子。但miR-140与结肠癌的关系尚不明确。本研究通过检测miR-140在结肠癌组织和细胞中的表达发现,miR-140在结肠癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常组织,并且在结肠癌细胞株中的表达较人正常结直肠黏膜细胞也明显降低,提示miR-140的异常低表达可能与结肠癌有关。本研究进一步通过体外细胞实验观察miR-140对结肠癌细胞生物学行为的影响。结果显示,在结肠癌HT29细胞中转染miR-140 mimics能明显抑制细胞的增殖和迁移能力。上述结果表明,miR-140在结肠癌中可能具有抗肿瘤的作用,同时过表达miR-140可以抑制结肠癌细胞的生物学行为。

miRNAs调控下游靶基因的表达,是miRNAs调控癌细胞增殖和肿瘤生成的重要机制[15]。因此,明确miRNA在疾病中调控的靶基因是研究miRNA工作机制的关键[16]。本研究采用TargetScan预测出SOX2的3′-UTR可与miR-140互补结合,提示SOX2是miR-140的潜在靶基因。转录因子SOX2在胚胎发育的各个阶段(包括细胞命运和分化)中都起着重要作用,这些关键的调节功能是通过结合特定的DNA序列并结合伴侣蛋白来发挥其作用的。最近,SOX2的过表达和基因扩增已与多种癌症类型(包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌和结肠癌)中的肿瘤侵袭和转移相关[17]。本研究通过双荧光素酶报告基因试验对SOX2是否为miR-140的靶基因进行了验证,结果显示miR-140能特异性结合SOX2的3′-UTR。并且过表达miR-140能明显下调结肠癌HT29细胞中SOX2的mRNA和蛋白表达表达。上述结果表明SOX2受miR-140的靶向调控。

图6 miR-140和SOX2在结肠癌裸鼠移植瘤模型中的作用 A:结肠癌裸鼠移植瘤图片; B:各组移植瘤免疫组化图片(bar=20 μm, 500倍)

有关研究表明 SOX2 不仅在胚胎发育中起着重要作用,在许多肿瘤也起着关键作用[18-19]。 比如Zhou等[20]在其研究结果SOX2在乳腺癌组织表达升高,同时有研究发现SOX2异常表达与结肠癌的发生发展有关[21]。本研究实验结果显示,SOX2在结肠癌细胞或组织中的表达明显高于人正常结直肠黏膜细胞FHC或癌旁正常组织,提示SOX2异常表达与结肠癌密切相关。我们进一步通过构建结肠癌裸鼠移植瘤模型观察miR-140对肿瘤的影响以及SOX2的表达变化情况。结果显示,在miR-140高表达的裸鼠中,瘤体大小明显小于对照组,并且肿瘤组织中SOX2和Ki67的表达也受到抑制,表明miR-140在裸鼠体内通过下调SOX2的表达抑制结肠癌细胞的增殖和肿瘤的生长。

综上所述,本研究实验结果表明miR-140的低表达与结肠癌密切相关,上调miR-140的表达能抑制结肠癌细胞的增殖和迁移能力,减缓裸鼠肿瘤的生长。并且在这一过程中发现SOX2是miR-140发挥调控作用的关键靶点,表明了miR-140可能通过直接靶向SOX2发挥抑制结肠癌的作用,为临床上结肠癌的防治提供了新的靶点。

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