四物汤改善多囊卵巢综合征大鼠卵巢功能实验研究*

朱 彤 张 楚 董浩旭 汪 辉 张明敏△

华中科技大学同济医学院附属同济医院1妇产科，2中西医结合科，武汉 430030

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一种临床常见妇科疾病，以月经稀发、高雄激素血症、卵巢多囊样改变、胰岛素抵抗为主要临床表现，继发月经不调、不孕症、心血管功能改变等疾病，严重影响女性身体健康和生殖功能[1-2]。目前，PCOS的发病原因仍未清晰，尚无法根治。研究[3-4]表明，应用具有整体调理效果的传统中药单独或辅助西药进行治疗，均能从多方面改善PCOS患者临床症状，达到调理月经、治疗不孕症等目的。四物汤(Siwu tang，SWT)作为“妇科第一方”，其补血活血特点在治疗PCOS方面具有独特优势，临床应用中取得了不俗的疗效[5-6]。基于此，本课题组设计了相关实验，以期观察SWT对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠动情周期、卵巢形态学及血清激素水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性Wistar大鼠25只，6～8周龄，SPF级，购自湖北省疾病预防与控制中心实验动物中心，饲养在同济医院SPF级动物房恒温(23±1)℃、恒湿(50±5)%的条件下，每日的明暗循环为12 h和12 h，所有实验均经华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理委员会批准(TJH-201901003)。

1.2 药物、试剂及主要仪器

SWT中药颗粒(华润三九医药有限公司)，由熟地黄、当归、白芍和川芎以4∶3∶3∶2的比例组成。来曲唑(Selleck)，二甲双胍(Solarbio公司)。戊巴比妥钠(武汉谷歌)，睾酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol，E2)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(德国Merck)，黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)ELISA试剂盒(武汉华联科公司)。

主要实验仪器：酶标仪(Biotek)，DM IL LED倒置显微镜(德国Feica)。

1.3 造模、分组及处理

将25只SPF级雌性Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、SWT低剂量组、SWT高剂量组和二甲双胍组，各5只。除对照组外，各实验组大鼠均采用来曲唑1 mg/(kg·d)灌胃诱导建立PCOS大鼠模型[7]，连续灌胃21 d。造模成功后，SWT低剂量组给予SWT 8.64 g/(kg·d)灌胃，SWT高剂量组给予SWT 25.92 g/(kg·d)灌胃，二甲双胍阳性对照组[8]给予二甲双胍200 mg/(kg·d)灌胃，对照组与模型组灌胃等量0.9%氯化钠注射液。各组均连续干预4周。

1.4 动情周期监测和统计

自造模开始即来曲唑干预第1天开始监测，使用移液枪吸取0.9%氯化钠注射液冲洗阴道，使用冲洗液制作阴道涂片，显微镜下观察细胞形态，以细胞类型判定大鼠动情周期，分为动情前期、动情期、动情后期和动情间期[9]。造模成功后，连续监测15 d，绘制动情周期曲线，统计各组大鼠的动情期时间。

1.5 卵巢形态学观察

末次干预结束后，采用40 mg/(kg·d)戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后处死大鼠，剖腹摘取双侧卵巢，4%多聚甲醛固定，24 h后进行石蜡包埋切片，并行常规HE染色，光学显微镜下观察卵巢组织病理学变化，统计黄体及囊肿数量。

1.6 血清激素水平检测

末次干预结束后，腹主动脉采血，离心取血清后，通过ELISA检测大鼠血清中FSH、LH、T、E2水平并计算LH/FSH比值，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 动情周期比较

与正常对照组相比，模型组大鼠动情周期明显改变，动情期显著缩短(P<0.05)。

与模型组大鼠相比，SWT低剂量组、SWT高剂量组和二甲双胍组大鼠动情周期有所恢复，动情期时间显著增加(P<0.05)。见图1。

1为模型组，2为对照组，3为SWT低剂量组，4为SWT高剂量组，5为二甲双胍组。与对照组比较▲P<0.05，与模型组比较*P<0.05图1 各组大鼠动情周期比较

2.2 卵巢形态学比较

与正常对照组相比，模型组大鼠卵巢形态明显改变，黄体数量显著减少(P<0.05)，囊肿数量显著增多(P<0.05)。

与模型组大鼠相比，SWT低剂量组、SWT高剂量组和二甲双胍组大鼠卵巢形态均有一定程度的恢复，黄体数量显著增加(P<0.05)，囊肿数量显著减少(P<0.05)。见图2。

A为卵巢HE染色，B为卵巢黄体数目，C为卵巢囊肿数目。1为模型组，2为对照组，3为SWT低剂量组，4为SWT高剂量组，5为二甲双胍组。与对照组比较▲P<0.05，与模型组比较*P<0.05图2 各组大鼠卵巢形态学情况

2.3 血清激素水平比较

与正常对照组相比，模型组大鼠血清T、LH水平显著升高，E2、FSH水平显著降低，LH/FSH比值明显升高(P<0.05)。

与模型组大鼠相比，SWT低剂量组、SWT高剂量组和二甲双胍组大鼠血清T水平及LH/FSH比值显著降低(P<0.05)；SWT低剂量组、SWT高剂量组大鼠血清E2水平显著升高(P<0.05)；SWT高剂量组大鼠血清FSH水平显著升高、LH水平显著降低(P<0.05)。见图3。

1为模型组，2为对照组，3为SWT低剂量组，4为SWT高剂量组，5为二甲双胍组。与对照组比较▲P<0.05，与模型组比较*P<0.05图3 各组大鼠血清激素水平比较

3 讨论

随着现代人类社会生活方式、饮食习惯的改变，PCOS发病率呈逐年升高趋势。PCOS的发病原因仍未明确，但现阶段的研究认为，该病的发生是由遗传层面的基因改变和后天环境包括饮食、运动、情绪等诸多因素共同决定。PCOS患者多因月经紊乱、不孕或者面部痤疮等原因前来就诊，临床上多将生活方式干预作为PCOS的治疗首选。对生活方式干预效果不理想或有其他治疗要求的患者，给予相应药物治疗，例如雌孕激素人工周期替代自然周期调理月经和排卵、避孕药或者螺内酯抗雄激素治疗面部痤疮、来曲唑或克罗米芬调节性腺轴功能诱导排卵治疗不孕症。上述治疗方法疗效均较为显著，但治疗效果持续时间较短，通常影响单个或几个月经周期，长期疗效较为欠缺。因此，寻找有效的替代或补充疗法，成为当前该病临床和基础研究的热点。

传统中医未有相应病名记载，依据其临床表现可将其归为“闭经”“经少”“不孕”等。结合中医理论，现代医家认为，PCOS的病位在肝脾肾三脏，主要病机包括气滞气虚、血虚血瘀等。SWT最早记载于唐代《仙授理伤续断秘方》，于宋代《太平惠民和剂局方》中被首次记载应用于妇科疾病。经过长期的临床应用，被后世医家称为“妇科第一方”“调理一切血证是其所长”，表明SWT在调理女性月经紊乱相关疾病领域具有十分重要的作用。SWT全方由当归、熟地黄、白芍、川芎4味中药组成，补肝脾之血虚、化肝脾之瘀血，妇女月经量少、经闭皆可用之。PCOS患者凝血功能、氧化应激相关指标均高于正常人群[10-11]；基础研究[12]表明，SWT具有类雌激素样、抗氧化、抗凝血、修复肝损伤等作用；临床研究[13]结果也显示，SWT加减可调理PCOS患者月经周期，提高患者排卵率和怀孕率。基于此，本课题组设计了相关实验，希望初步探明SWT治疗PCOS的起效机制和作用方式。

排卵障碍是PCOS患者的常见特点，也是大多数患者月经不调、不孕症等的来源。通过观察，我们发现来曲唑诱导的PCOS模型大鼠出现了动情周期的显著改变，其出现与人类排卵期相对应的动情期时间显著减少，表明大鼠排卵功能受损。通过药物干预治疗，我们发现SWT低剂量组、SWT高剂量组和二甲双胍组3个治疗组均能有效改善大鼠动情周期结构；与模型组大鼠相比，可显著增加动情期的出现时间，减少动情间期时间；其中，SWT高剂量组大鼠动情期增加最为明显。表明高低剂量SWT、二甲双胍均能有效改善PCOS大鼠排卵功能，且高剂量SWT效果最优。

卵巢的形态学改变是PCOS患者的诊断标准之一，表明患者的卵巢功能出现异常。通过HE染色，我们观察到PCOS模型大鼠卵巢出现了与临床相类似的多囊样改变，表现为囊肿数量增加、黄体数量显著降低。治疗干预后，与模型组对比，SWT低剂量组和SWT高剂量组2组大鼠卵巢囊肿数量降低、黄体数量显著升高，而作为阳性对照的二甲双胍组大鼠虽然同样表现出卵巢囊肿数量降低，黄体数量却没有统计学差异；这与动情周期的统计结果是相符合的，高低剂量SWT能有效改善PCOS大鼠卵巢形态，一定程度地恢复其卵巢功能。

PCOS患者血清性激素、促性腺激素水平往往异于正常人群，表现为T浓度、LH/FSH比值的异常增高，不仅会直接抑制卵泡的发育和成熟，引起上述排卵功能障碍和卵巢形态功能改变，高雄激素还会诱发机体出现胰岛素抵抗、慢性炎症状态、氧化应激的异常激活等多种代谢功能异常，导致整体功能稳态破坏和局部组织损伤。而雌激素水平的降低，表明其主要分泌来源的卵巢颗粒细胞功能受损，影响子宫内膜的发育和着床时的容受性。实验结果显示，与正常对照大鼠相比，PCOS模型大鼠血清T、LH浓度显著升高，E2、FSH浓度显著降低，且LH/FSH升高，表明PCOS大鼠出现了与临床患者相类似的血清激素水平变化。药物治疗后，3组大鼠的血清T浓度、LH/FSH比值均显著降低；SWT低剂量组和SWT高剂量组大鼠血清E2浓度显著升高，有且仅有SWT高剂量组大鼠表现出FSH浓度升高、LH浓度降低。上述结果表明，高低剂量SWT和二甲双胍均能在一定程度上纠正PCOS大鼠血清激素水平的异常变化，且SWT的效果明显优于二甲双胍。

综上，SWT可通过纠正PCOS大鼠血清激素水平，一定程度上恢复下丘脑-垂体-卵巢性腺轴功能，改善卵巢排卵功能。本次实验初步探讨了SWT治疗PCOS的起效机制，为该方的临床应用和更深层次的机制研究提供了一定参考依据。