低氧诱导因子-1α在视网膜母细胞瘤肿瘤生物学及治疗中的作用研究进展

刘景晨 李蕾 徐兵 孙曙光

【摘要】 缺氧是中晚期视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）发生率非常高的微环境改变，缺氧调节的主要因子低氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factors-1α，HIF-1α）在RB的肿瘤生物学方面发挥着关键作用。因此，HIF-1α在RB肿瘤生物学中的作用研究是开发新的抗RB药物及治疗的重点所在，本文对HIF-1α在RB肿瘤生物学方面的作用及基于HIF-1α抗RB研究的方面做一综述，为RB的治疗寻找新的方向。

【关键词】 缺氧诱导因子-1α 视网膜母细胞瘤 肿瘤生物学 化疗

[Abstract] Hypoxia is a very high incidence of microenvironmental changes in advanced retinoblastoma（RB）. Hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）， the key factor in the regulation of hypoxia microenvironment， plays a key role in retinoblastoma cell proliferation，tumor metastasis， tumor angiogenesis， drug resistance generation and differentiation of tumor stem cells. Therefore， the study on the role of HIF-1α in RB tumor biology is the focus of the development of new anti-rb drugs and treatments. In this paper， the biological role of HIF-1α in RB tumor and the anti-RB research based on HIF-1α were reviewed， so as to find a new direction for the treatment of RB.

[Key words] Hypoxia inducible factors-1α Retinoblastoma Tumor biology chemotherapy

视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma，RB）是5岁以下的儿童眼部发病率最高的恶性肿瘤，在全球范围内该病的发病率为1/15 000～1/20 000，在全部儿童致盲性疾病中约占5%，具有高侵袭性和转移性[1-4]。由于亚太地区人口的爆发性增长，使该地区的RB患者数量达到全球的43%[5]，但较差的社会经济及医疗水平，使得很多患儿不能得到及时的诊断与治疗，在我国西南部地区，部分患兒就诊时已处于临床中晚期[6]，因此该病一直是眼科的热点，随着对RB认识的不断深入，学者们发现HIF-1α与RB的疾病进展密切相关。

缺氧是迅速增长的肿瘤组织内由于循环供应不足而产生的一种生理效应[7]，肿瘤细胞内多种与肿瘤生物学相关的基因在氧缺乏情况下可发生转录和表达的改变，在肿瘤适应缺氧的调节中以HIF-1α最为重要[8]。在肿瘤生长和转移中，HIF-1α及其调控的相关因子起关键作用，高表达的HIF-1α预示着肿瘤不良的预后[9]。HIF-1是一种具有转录活性的异二聚体转录因子，由α和β两个亚基组成，β亚基的mRNA和蛋白在常氧及低氧时均维持在恒定的水平，是非氧调节亚基。α亚基是氧调节亚基，细胞氧供应充足时，在泛素化-蛋白酶体途径作用下降解，难于发挥生物学作用。但在缺氧时，泛素化途径受到抑制，HIF-1α降解减少而在细胞内积累，在细胞核中与HIF-1的β亚基特异性地结合为有转录活性的二聚体结构，激活细胞增殖、分化、凋亡、血管生成、肿瘤侵袭等基因的转录[10]，使癌细胞适应缺氧环境并促进癌症的进展，导致RB的不良预后及对传统治疗方法的抵抗[11]。

1 RB组织的缺氧微环境及HIF-1α高表达

肿瘤内氧供应与肿瘤细胞和毛细血管的距离有关，随着距离增加，氧浓度下降，细胞出现氧供应不足，当距离大于氧气的扩散范围（100～200 μm）时，可以导致缺氧微环境的形成[12]。肿瘤细胞氧供应不足时，HIF-1a的表达增多，可以通过调控不同基因的表达，以适应低氧环境[13]。岳晗[14]通过免疫组化分析39只眼的RB组织标本研究发现，有29例标本的HIF-1α呈阳性，阳性率达74.4%，且在RB瘤体中HIF-1α的高表达多位于边缘地带，可能和RB增殖过程中边缘区血管分布较少，氧供应不足有关。Sudhakar等[15]通过对42例RB组织免疫组化分析发现，83%的病例中HIF-1α呈阳性表达，证实缺氧微环境在中晚期RB患者瘤体内普遍存在。游志鹏等[16]对国内RB标本的研究发现，HIF-1α主要表达于RB的细胞核及部分胞浆，不同临床分期的RB的HIF-1α的表达程度不同，两者呈正相关。

2 HIF-1α与RB肿瘤生物学

2.1 HIF-1α对RB增殖和存活的影响 快速增殖是肿瘤的特征，缺氧条件下HIF-1α与肿瘤细胞的增殖密切相关，Fernandes等[17]发现在Y79系RB细胞中抑制HIF-1α的表达后，可以导致RB细胞的增殖能力明显降低。郎莉莉等[18]使用siRNA技术沉默Y79细胞中HIF-1ɑ的表达后，发现肿瘤细胞中Bax/Bcl-2比值升高、继而活化Caspase-9和Caspase-3，诱导Y79细胞的凋亡。夏天等[19]对RB移植瘤裸鼠进行瘤体内多点注射HIF-1αsiRNA，在对比实验组与对照组发现，在相同的观察时间内，实验组的RB瘤体生长速度明显慢于对照组，且肿瘤的重量低于对照组裸鼠，说明在裸鼠体内，HIF-1αsiRNA沉默HIF-1α基因后，可以有效的抑制RB移植瘤增殖。另外Xia等[20]也发现在缺氧条件下，诱导HIF-1α沉默后，WERI-RB1细胞内凋亡抑制蛋白Survivin mRNA的水平下降，细胞的增殖降低，凋亡增加。说明HIF-1α在缺氧状态下与RB细胞增殖关系密切，沉默HIF-1α的表达，可使RB的增殖降低，细胞的凋亡增加。

2.2 HIF-1α对RB侵袭和转移的影响 基质金属蛋白酶家族（MMPs）具有降解细胞外基质的功能，在恶性肿瘤的侵袭与转移过程中发挥着重要的作用，资料表明HIF-1α可以调控该家族中MMP-2、MMP-9的表达[21]，促进RB的发展，并提示肿瘤的不良预后[22]。Wan等[23]通过对45例RB组织和15例正常视网膜组织的MMP-2表达情况分析发现，与正常视网膜组织相比，MMP-2在RB中的表达明显升高，且在未分化的RB组织及有视神经转移的标本中，MMP-2有更高的表达水平，表明MMP-2的高表达可以促进RB侵犯视神经。另外Long等[24]对41例RB标本的研究也证实，在肿瘤标本中MMP-2和MMP-9的表达升高，且在有视神经侵犯的RB中具有更高的表达水平。Li等[25]人体外研究发现，在缺氧条件下的HXO-RB44细胞中，活化的HIF-1α对MMP9的转录有明显的激活作用，促进基底膜降解，从而增加HXO-RB44细胞的侵袭能力。因此HIF-1α可通过调控MMP-2、MMP-9基因的表达而促进RB的侵袭和转移。

2.3 HIF-1α促进RB肿瘤血管的生成 血管生成是在相关细胞因子的作用下，刺激已有的血管产生新的毛细血管的过程，是肿瘤适应缺氧状态的一种反应[21]，血管生成被认为是癌症的标志[26]，对于肿瘤的持续生长和转移至关重要[27]，新生成的血管在结构和功能上存在异常，使得肿瘤细胞容易进入新生血管，进而由血液系统向远处转移[28]。HIF-1α在体内可以调控血管内皮生长因子（VEGF）的表达，参与调控肿瘤新生血管的形成[21，29]。研究表明在RB组织切片中HIF-1α与VEGF均呈高表达，两者的表达水平呈正相关，且在肿瘤的不同区域，两者的表达具有较高的一致性[14]。另外Wu等[30]发现相对于视神经未受累的病例，在受累病例的RB组织中具有更高的VEGF水平，且在低分化区RB组织VEGF表达水平要明显高于高分化区。说明VEGF过表达可能促进RB向视神经转移，与不良的预后相关。

2.4 HIF-1α增加RB对化疗的耐药性 化疗的耐药性是当前临床抗肿瘤治疗的难题，肿瘤细胞微环境在肿瘤化疗耐药作用中扮演着重要的角色[31]，缺氧是最常见的肿瘤微环境，当前的化疗针对的是高氧和增殖的癌细胞，但对低氧细胞的效果较差[21]。当肿瘤细胞处于缺氧条件下，其新陈代谢和增殖速度缓慢，易出现对化疗药物的不敏感[32]。Gao等[33]在体外使用脑源性神经营养因子（BDNF）作用于Y79系RB细胞，诱导细胞中的HIF-1α高表达，发现细胞对化疗药物诱导的细胞毒性和细胞凋亡的抵抗性增强，而在使用siRNA沉默HIF-1α的表达后，Y79细胞对药物的抵抗性降低。Yin等[34]发现，缺氧时RB细胞内的HIF-1α可与lncRNA ANRIL的启动子相互结合，促进ANRIL的表达，通过ANRIL使耐药相关蛋白（ABCG2和MDR1）得表达增强，使RB细胞对顺铂的抵抗力增加，细胞的凋亡减少。说明缺氧时细胞内高表达的HIF-1α可调控细胞内的相关的基因表达，诱导与耐药有关的因子表达增加，增加RB细胞对化疗药物的抵抗力。

2.5 HIF-1α促进RB肿瘤干细胞形成 肿瘤干细胞（CSCs）是肿瘤细胞中具有类似正常干细胞特性[35]，能自我更新、多向分化及无限增殖的一个亚群，同时又体现出对化疗药的抗药性、极强的成瘤性及较强的侵袭和转移能力[36]，传统的化疗药物对肿瘤干细胞的治疗效果不大，非干细胞特性的肿瘤细胞经化疗后消失，残留的肿瘤干细胞可继续快速增殖，由此形成的复发肿瘤将具有更强的耐药性[37]，后续治疗极为困难，因此对CSCs研究是治疗肿瘤的一个重要方向。资料表明在肿瘤细胞中，HIF-1α对CSCs的诱导和增殖具有明显的影响[7]。张丽娜等[38]对Y79系RB细胞进行低氧培养后，使用流式细胞仪检测ATP結合盒膜转运蛋白G2（ABCG2）及神经元特异性烯醇化酶（NES）发现，在低氧组RB细胞中RB细胞标记物NES蛋白呈阳性的细胞明显低于正常组和预处理组，而肿瘤干细胞的标志物ABCG2蛋白表达呈阳性的细胞明显高于正常组和预处理组，说明低氧组可以诱导部分RB细胞去分化为肿瘤干细胞，但在使用雷帕霉素处理的预处理组，由于雷帕霉素对HIF-1α活性具有抑制作用，其ABCG2蛋白及NES蛋白检测阳性率与正常培养组无差异，缺氧诱导RB细胞去分化为肿瘤干细胞的作用不明显，证实在氧供应不足情况下，HIF-1α是诱导RB细胞去分化为肿瘤干细胞的重要调节因子。

3 针对HIF-1α的RB治疗

3.1 小干扰RNA（small interference RNA，siRNA） siRNA通过RNA干扰机制，可以实现高效的靶基因沉默，影响基因表达，调节基因活性，因而在肿瘤治疗方面受到广泛关注[39]。Gao等[11]通过siRNA抑制Y79系RB细胞中HIF-1α的表达，发现下调HIF-1α后，Bax/Bcl-2比值升高，Caspase-9及Caspase-3激活，导致肿瘤细胞增殖减少，细胞的凋亡增加，并发现缺氧状态下这种抑制作用更敏感。夏天等[19]通过对RB移植瘤裸鼠模型瘤体内多点注射HIF-1αsiRNA干扰瘤体内HIF-1α的表达后发现，与对照组相比在相同的时间点，干扰组裸鼠RB皮下移植瘤生长明显减慢，瘤体肿瘤明显减轻，说明HIF-1α对裸鼠体内的RB移植瘤的增殖有促进作用，通过siRNA技术沉默HIF-1α表达，进而抑制RB生长，可作为RB治疗的一个研究方向。

3.2 色素上皮衍生因子 色素上皮衍生因子（PEDF）是一种有效的眼部血管生成抑制剂[40]，早期资料表明，PEDF可刺激RB的分化，具有抗血管生成、抑制肿瘤转移的作用[41]，使其受到研究者的广泛关注。Yang等[42]通过使用PEDF作用于SO-RB50细胞及SO-RB50小鼠模型后，发现在体内及体外实验中HIF-1α的表达均被PEDF下调，并且降低了HIF-1α向细胞核内的转运，减少了肿瘤细胞中受HIF-1a调控的VEGF的表达，VEGF的表达下降导致其旁分泌作用减弱，对RB组织中内皮细胞增殖和血管通透的影响降低，从而抑制了RB的生长。

3.3 中藥治疗 中药在抗RB治疗方面是当前研究的热点，多种中药成分证实对肿瘤缺氧具有治疗作用[43-45]，雷公藤红素是雷公藤中的具有生物活性的天然化合物[46]，Li等[47]研究发现雷公藤红素对缺氧诱导的HIF-1α和VEGF有明显抑制作用，在体外培养的鸡胚绒毛尿囊膜中，改善药物水溶性的雷公藤红素的纳米微球（CNMs）能抑制SO-Rb50细胞诱导的血管发芽和血管形成。另外在SO-Rb50异种移植的NOD-SCID的小鼠使用CNMs进行腹部注射治疗，发现与对照组相比，相同时间点，CNMs注射组的肿瘤重量和体积显著降低，肿瘤血管生成减少。提示CNMs可能是通过靶向HIF-1α/VEGF通路，抑制视网膜母细胞瘤生长和血管生成。

4 展望

作为RB缺氧调节最关键的因子HIF-1α，其在RB细胞的多种生物学方面发挥着重要作用，目前靶向HIF-1α治疗RB的药物尚未应用于临床，但随着对RB缺氧微环境及HIF-1α研究的不断深入，以靶向HIF-1α基础，抑制RB细胞耐药、血管形成、细胞增殖等治疗方式将不断出现，为RB治疗提供新思路和新选择，帮助更多的患儿远离疾病的痛苦。

参考文献

[1] Ke F，Yu J，Chen W，et al.The anti-malarial atovaquone selectively increases chemosensitivity in retinoblastoma via mitochondrial dysfunction-dependent oxidative damage and Akt/AMPK/mTOR inhibition[J].Biochem Biophys Res Commun，2018，504（2）：374-379.

[2] Soliman S E， VandenHoven C， MacKeen L D，et al. Secondary Prevention of Retinoblastoma Revisited： Laser Photocoagulation of Invisible New Retinoblastoma[J].Ophthalmology，2020，127（1）：122-127.

[3] Rao R， Honavar S G. Retinoblastoma[J].Indian J Pediatr，2017，84（12）：937-944.

[4] Yang M，Wei W.Long non-coding RNAs in retinoblastoma[J].Pathol Res Pract，2019，215（8）：152435.

[5] Jain M，Rojanaporn D，Chawla B，et al.Retinoblastoma in Asia[J].Eye （Lond），2019，33（1）：87-96.

[6] Gao J，Zeng J，Guo B，et al.Clinical presentation and treatment outcome of retinoblastoma in children of South Western China[J].Medicine （Baltimore），2016，95（42）：e5204.

[7] Hajizadeh F，Okoye I，Esmaily M，et al.Hypoxia inducible factors in the tumor microenvironment as therapeutic targets of cancer stem cells[J].Life Sci，2019，237：116952.

[8] Peng X，Gao H，Xu R，et al.The interplay between HIF-1α and noncoding RNAs in cancer[J].J Exp Clin Cancer Res，2020，39（1）：27.

[9] Lin M C，Lin J J，Hsu C L，et al. GATA3 interacts with and stabilizes HIF-1α to enhance cancer cell invasiveness[J].Oncogene，2017，36（30）：4243-4252.

[10] Tang W，Zhao G.Small molecules targeting HIF-1α pathway for cancer therapy in recent years[J].Bioorg Med Chem，2020，28（2）：115235.

[11] Gao Y，Jing M，Ge R，et al.Inhibition of Hypoxia Inducible Factor 1α by siRNA-Induced Apoptosis in Human Retinoblastoma Cells[J].Journal of Biochemical & Molecular Toxicology，2014，28（9）：394-399.

[12] Gilkes D M，Semenza G L，Wirtz D.Hypoxia and the extracellular matrix： drivers of tumour metastasis[J].Nature Reviews Cancer，2014，14（6）：430-439.

[13] Soni S，Padwad Y S.HIF-1 in cancer therapy： two decade long story of a transcription factor[J].Acta Oncol，2017，56（4）：503-515.

[14]岳晗.视网膜母细胞瘤中HIF-1α的区域性表达及其与增殖、凋亡和新生血管生成的关系[D].上海：复旦大学，2011.

[15] Sudhakar J，Venkatesan N，Lakshmanan S，et al.Hypoxic tumor microenvironment in advanced retinoblastoma[J].Pediatr Blood Cancer，2013，60（10）：1598-1601.

[16]游志鵬，宋华，赵菊莲.HIF-1α在视网膜母细胞瘤中的表达及意义[J].中国现代医学杂志，2009，19（18）：2844-2846，2849.

[17] Fernandes B F，Coates J，Odashiro A N，et al.Hypoxia-inducible factor-1α and its role in the proliferation of retinoblastoma cells[J].Pathol Oncol Res，2014，20（3）：557-563.

[18]郎莉莉，高玉，葛茸茸，等.siRNA抑制缺氧诱导因子-1ɑ表达对人视网膜母细胞瘤细胞增殖与凋亡的影响[J].海军医学杂志，2016，37（1）：22-26.

[19]夏天.沉默缺氧诱导因子HIF-1α基因对视网膜母细胞瘤生长与凋亡的影响[D].郑州：郑州大学，2013.

[20] Xia T，Cheng H，Zhu Y.Knockdown of hypoxia-inducible factor-1 alpha reduces proliferation， induces apoptosis and attenuates the aggressive phenotype of retinoblastoma WERI-Rb-1 cells under hypoxic conditions[J].Ann Clin Lab Sci，2014，44（2）：134-144.

[21] Schito L，Semenza G L.Hypoxia-Inducible Factors： Master Regulators of Cancer Progression[J].Trends in Cancer，2016，2（12）：758-770.

[22] Zhu J，Zhang X，Ai L，Yuan R， et al.Clinicohistopathological implications of MMP/VEGF expression in retinoblastoma： a combined meta-analysis and bioinformatics analysis[J].J Transl Med，2019，17（1）：226.

[23] Wan W C，Jin X M，Zheng G Y，et al.how expressions of claudin-1 and mmp-2 in retinoblastoma correlate with histological differentiation and optic nerve invasion[J].J Biol Regul Homeost Agents，2015，29（2）：373-378.

[24] Long H，Zhou B，Jiang F G.Expression of MMP-2 and MMP-9 in retinoblastoma and their significance[J].Int J Ophthalmol，2011，4（5）：489-491.

[25] Li Y Y，Zheng Y L.Hypoxia promotes invasion of retinoblastoma cells in vitro by upregulating HIF-1α/MMP9 signaling pathway[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21（23）：5361-5369.

[26] Tang E，Wang Y，Liu T，et al.Gastrin promotes angiogenesis by activating HIF-1α/β-catenin/VEGF signaling in gastric cancer[J].Gene，2019，704：42-48.

[27] Dewangan J，Srivastava S，Mishra S，et al.Salinomycin inhibits breast cancer progression via targeting HIF-1α/VEGF mediated tumor angiogenesis in vitro and in vivo[J].Biochem Pharmacol，2019，164：326-335.

[28]闫慧，张磊.视网膜母细胞瘤转移机制及基因治疗的研究进展[J].同济大学学报（医学版），2016，37（1）：129-132.

[29] Shukla K，Sonowal H，Saxena A，et al.Didymin by suppressing NF-κB activation prevents VEGF-induced angiogenesis in vitro and in vivo[J].Vascul Pharmacol，2019，115：18-25.

[30] Wu Q， Sun X， Zheng G.VEGF overexpression is associated with optic nerve involvement and differentiation of retinoblastoma： A PRISMA-compliant meta-analysis[J].Medicine （Baltimore），2018，97（51）：e13753.

[31] Xia Yu，Jiang Lixia，Zhong Tianyu.The role of HIF-1α in chemo-/radioresistant tumors[J].Onco Targets and Therapy，2018，11：3003-3011.

[32] Liang Y，Chen X，Liang Z.MicroRNA-320 regulates autophagy in retinoblastoma by targeting hypoxia inducible factor-1α[J].Exp Ther Med，2017，14（3）：2367-2372.

[33] Gao Y，Jing M，Ge R，Lang L.Induction of hypoxia-inducible factor-1α by BDNF protects retinoblastoma cells against chemotherapy-induced apoptosis[J].Mol Cell Biochem，2016，414（1-2）：77-84.

[34] Yin X，Liao Y，Xiong W，Zhang Y，et al.Hypoxia-induced lncRNA ANRIL promotes cisplatin resistance in retinoblastoma cells through regulating ABCG2 expression[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2020，47（6）：1049-1057.

[35] Tong W W，Tong G H，Liu Y.Cancer stem cells and hypoxia-inducible factors （Review）[J].Int J Oncol，2018，53（2）：469-476.

[36]杨栋，张培彤.肿瘤干细胞在恶性肿瘤发生、耐药、侵袭及转移中的作用[J].实用癌症杂志，2015，30（4）：629-632.

[37]郭海啸，栾婷，王海峰，等.肿瘤干细胞在化疗耐药机制中的研究进展[J].实用医学杂志，2019，35（1）：163-166.

[38]张丽娜，赵桂秋，王谦，等.低氧条件下视网膜母细胞瘤细胞表达肿瘤干细胞标志物及向内皮样细胞诱导分化的体外研究[J].中华眼科杂志，2013，49（8）：736-743.

[39] Hu B，Weng Y，Xia X H，et al.Clinical advances of siRNA therapeutics[J].J Gene Med，2019，21（7）：e3097.

[40] Becerra S P，Notario V.The effects of PEDF on cancer biology： mechanisms of action and therapeutic potential[J].Nat Rev Cancer，2013，13（4）：258-271.

[41] Belkacemi L，Zhang S X.Anti-tumor effects of pigment epithelium-derived factor （PEDF）： implication for cancer therapy. A mini-review[J].J Exp Clin Cancer Res，2016，35：4.

[42] Yang H，Cheng R，Liu G，et al.PEDF inhibits growth of retinoblastoma by anti-angiogenic activity[J].Cancer Sci，2009，100（12）：2419-2425.

[43]劉丹，刘婷，赵乐，等.人参皂苷Rg1通过NF-κB阻断缺氧诱导卵巢癌SKOV3细胞EMT[J].中国妇幼健康研究，2017，28（3）：273-275，278.

[44]翁苓苓，高玲，张闽光.天冬多糖低氧下抑制肝癌作用的体外实验研究[J].现代中西医结合杂志，2019，28（24）：2623-2628.

[45]冯兵，朱莹，贺嵩敏，等.罗勒多糖对缺氧条件下肝癌细胞组蛋白H3K9me2甲基化及G9a、JMJD1A表达的影响[J].中药材，2015，38（7）：1460-1465.

[46]赵楠，王红，穆春青，等.雷公藤红素抑制A549人肺癌细胞的增殖并增加其凋亡[J].细胞与分子免疫学杂志，2018，34（12）：1111-1115.

[47] Li Z，Guo Z，Chu D，et al.Effectively suppressed angiogenesis-mediated retinoblastoma growth using celastrol nanomicelles[J].Drug Deliv，2020，27（1）：358-366.

（收稿日期：2020-05-25） （本文编辑：周亚杰）