基于微卫星标记的不同种质资源罗氏沼虾遗传多样性研究

许珊华 章嘉淇 卢婷

摘要：为探究江浙地区不同罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）群体的遗传多樣性和遗传结构，利用16个微卫星标记对潮丰（CF）、蓝天（LT）、源泉A（YQA）、源泉B（YQB）、嘉丰（JF）、南太湖（NTH）等6个江浙地区养殖群体和1个泰国正大（ZD）引进群体进行遗传变异分析。结果显示，16个微卫星位点均为高度多态位点;7个群体均为较高的遗传多样性，期望杂合度（He）和多态信息含量（PIC）均大于0.7，遗传多样性大小排序为ZD>YQA>YQB>JF>LT>NTH>CF;遗传分化指数（Fst）分析结果显示，泰国正大与江浙地区各群体间存在中等程度的遗传分化，Fst介于 0.101 45～0123 48之间;江浙地区群体除NTH与CF群体间为中等程度遗传分化（Fst=0.050 98）外，其余群体间的遗传分化程度较低，Fst介于0.015 71～0.040 99之间。AMOVA分析结果显示，遗传变异主要发生在个体内和群体内个体间，群体间遗传变异仅占2.10%。依据Neis遗传距离构建的非加权组平均法（UPGMA）系统进化树显示，泰国正大群体独占一支，江浙地区6个群体聚为另一支。Structure分析结果显示，所有样本被划分为2个理论群，江浙地区6个群体为一个集群，泰国正大群体为一个集群。该研究不但揭示了江浙地区罗氏沼虾养殖群体的遗传多样性现状，而且也为罗氏沼虾种质资源的保护、利用以及优良品种的选育提供了参考信息。

关键词：罗氏沼虾;微卫星标记;遗传多样性;遗传结构;种质资源

罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）别称马来西亚大虾、泰国虾、淡水长臂大虾等，是世界上最大的淡水虾，原产于东南亚地区，具有重要的经济价值和营养价值[1-2]。其食性广、生长快、个体大、壳薄体肥、肉质鲜嫩、营养丰富，因而成为广泛养殖的淡水虾，2016年全球产量达23.4 万t[3-4]。罗氏沼虾于1976年由中国农业科学院首次引入我国大陆[5]，随后在我国十多个省市自治区广泛进行养殖，且产量不断增加，2018年产量达13.33万t[6]。目前，我国已成为全球罗氏沼虾养殖量最多的国家，养殖产量占世界总产量的50%以上[7]。但在罗氏沼虾产业迅速发展的同时也面临诸多问题，如抗病力下降、生长速度减缓、个体质量减小、性成熟提早等，究其原因主要在于种质资源遗传多样性的丧失。养殖的罗氏沼虾在世代繁衍过程中，往往由于亲本更新不及时和种群较小，而出现近亲繁殖的现象，导致了其遗传多样性的逐渐丧失和种质的退化[8-10]。Miao等报道了一些养殖物种因近交而产生了遗传衰退，而这种遗传衰退已经是一个很严重的问题了，因为它不仅影响产量和经济效益，还影响了衰退物种所在的自然生态系统和发展的可持续性[11]。遗传多样性是物种进化依赖的基础，与种群的适应能力、生存能力及进化能力呈正相关[12]。准确评价种质资源的遗传多样性可以为亲本选择、后代遗传变异和杂种优势预测提供预测指导，提高育种效率[13]。因此，了解现有罗氏沼虾种质资源的遗传多样性和遗传结构对种质资源的有效保护、高效利用，现有性状的改良，新品种的选育等都至关重要。

微卫星（microsatellite）标记凭借着其在基因组中分布广泛、多态性丰富、具有共显性、高突变率等优点而被广泛用于群体遗传多样性检测和遗传结构的分析[14-15]。目前，已有一些采用微卫星标记对罗氏沼虾不同养殖和野生群体进行遗传多样性研究的报道，但这些报道多数是研究我国台湾[16]和国外[17-21]罗氏沼虾群体遗传多样性的，我国大陆报道的研究主要集中在广东和广西地区[19-22]的罗氏沼虾养殖群体，而关于江苏省和浙江省的罗氏沼虾养殖群体的报道较少，仅见于文献[19-21]，且群体数量较少。江苏省和浙江省是罗氏沼虾的主要养殖区，2018年这2个省的产量占全国罗氏沼虾养殖总产量的62%，这2个省也均是罗氏沼虾苗种的培育基地[6]。罗氏沼虾引入我国已有44年，这期间尽管有多次小规模的重新引种，也有选育新品种（南太湖2号），但多数育苗场仍然缺乏科学的选育技术和保种措施[20]。因此，本研究选取江苏和浙江地区的6个养殖群体和1个泰国引进群体（作为参比群体），利用微卫星标记对江浙和泰国群体的遗传变异进行比较分析，旨在了解江浙地区现有罗氏沼虾种质资源遗传多样性的现状，以期为我国罗氏沼虾种质的保护利用和优良品种的选育提供参考信息。

1 材料与方法

1.1 试验材料与基因组DNA的提取

试验样品分别取材于不同的罗氏沼虾养殖户，其虾苗来源于6家育苗企业（图1）。江浙地区6个养殖群体分别为潮丰（CF，30尾，湖州市潮丰水产育苗公司）、蓝天（LT，30尾，浙江蓝天生态农业开发有限公司）、源泉A（YQA，30尾，湖州源泉水产有限公司）、源泉B（YQB，30尾，湖州源泉水产有限公司）、嘉丰（JF，30尾，扬州市嘉丰罗氏沼虾良种繁殖有限公司）和南太湖（NTH，30尾，浙江南太湖淡水水产种业有限公司），1个泰国正大引进群体（ZD，30尾，嘉兴丰源农业科技有限公司）。每尾虾均剪取其背部肌肉组织，放置于无水乙醇中储存。

取少量样品于1.5 mL的离心管中，尽量剪碎，于烘箱中烘干。加入HOM Buffer和蛋白酶K，摇匀后置于55 ℃摇床中消化至透明，再加入三氯甲烷抽提、离心，将上清液转移，于-20 ℃沉淀，最后漂洗、干燥，加入双蒸水溶解。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和完整性。采用紫外分光光度计检测DNA质量和浓度，部分稀释至50 ng/μL，剩余DNA保存于-20 ℃冰箱中。

1.2 微卫星引物、PCR扩增和PCR样品测序

16对引物来自文献[20-22]，由表1可知，引物均由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。

PCR扩增体系为25 μL， 含MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、上下游引物各1.0 μL、ddH2O 15.9 μL、DNA 2.0 μL、rTaq 0.1 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性30 s，55～65 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸30 s，35个循环;最后72 ℃延伸10 min。

合格的PCR样品委托武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序分析。

1.3 数据统计和分析

利用PopGene 1.32软件计算等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon信息指数（I）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、Nei氏遗传距离、遗传相似度、近交系数（Fis）、基因流（Nm）[23];采用Cervus 3.0软件进行多态信息含量（PIC）的计算[24]。根据Nei氏遗传距离用MEGA 4.0软件来构建群体间聚类图[25]。采用Arlequin 3.5软件进行群体间遗传分化指数（Fst）计算和分子方差分析（AMOVA）[26]。采用Structure 231软件分析群体遗传结構[27]，利用在线软件（http：//clumpak.tau.ac.il/）得出最佳的理论群体数（K值），并绘制群体遗传结构图。

1.4 试验时间和地点

试验于2018年7月开始，2019年12月结束。试验地点为中国水产科学研究院水生动物繁育与营养重点实验室。

2 结果与分析

2.1 微卫星位点的多态性分析

由微卫星位点多样性统计结果（表2）可知，16个位点共检测出323个等位基因（Na），Na为10～29个，每个位点平均有20个。Ne为2.611 5～12431 6个，平均值为7.939 3个。Na与Ne数值相差较大，说明群体中等位基因分布不均匀。I为1376 0～2.738 2，平均值为2.276 5，I值较大，说明群体的遗传多样性高。Ho为0.329 7～1.000 0，平均值为0650 2。He为0.618 6～0.921 8，平均值为 0.834 7。16个位点中有13个位点的Ho低于He，说明群体内自交率较高。PIC为0.539 7～0.872 4，平均值为0.776 1。根据Botstein等划分标准，16个位点的PIC均高于0.5，为高度多态性[28]。F检验数据显示，有4个位点的Fis为负值，其余12个为正值，说明近交程度高。根据Wright建议，有6个位点的遗传分化很小（Fst<0.05），有10个位点的遗传分化为中等（0.05 2.2 罗氏沼虾7个群体多态性分析    7个群体的遗传多样性。由表3可知，7个群体的Na介于9.625 0～12.187 5之间，Ne介于5.078 1～7261 2之间， I介于1.770 6～2.148 4之间，Ho介于0.621 4～0.702 8之间，He介于0.764 4～0.859 6 之间，PIC介于0.744 3～0.825 8之间。泰国正大群体的遗传多样性参数均高于江浙地区的6个罗氏沼虾群体，CF群体的各参数均为最小。Ne、I和PIC在7个群体内趋势一致，表现为ZD>YQA>YQB> JF>LT>NTH>CF。 7个群体的多态信息含量均高于0.7，说明该研究的7个群体有丰富的遗传多样性。

2.3 群体间遗传分化与遗传距离的分析

由表4可知，群体间遗传分化，泰国正大与所有群体间的Fst介于0.101 45～0.123 48之间，为中等程度的遗传分化（0.05   由表6可知，7个罗氏沼虾群体的遗传距离介于0.095 0～1.027 4之间，CF和ZD群体遗传距离最远，为1.027 4，遗传相似度最低，为0.357 9。LT和CF群体遗传距离最小，为0.095 0，遗传相似度最大，为0.909 4。由图2可知，为根据Neis遗传距离构建的非加权组平均法（UPGMA）聚类树，此树分为2支：泰国正大群体独占一支，江浙地区的群体聚为一支。江浙地区的群体这一支又分为2支：NTH群体为一支，其余群体为一支（此支又分为2支：CF与LT聚为一支，YQB、JF和YQA聚为一支）。

2.4 群体遗传结构分析

将Burnin运算长度设置为100 000，K值预设为1～7，每个K值重复10次，在K=2时，Delta K最大，即所有参试个体最佳分组为2个理论群。由图3可知， 在K=2的情况下， 江浙地区的6个群体为一个集群，泰国正大群体为一个集群。在K=3的情况下，CF、LT、YQB、YQA和JF聚为一群，NTH和ZD分别独立成群。在K=4的情况下，CF和LT为一个集群，YQB、JF和YQA为一个集群，NTH和ZD分别独立成群。

3 讨论

3.1 微卫星位点的遗传多样性

多态信息含量可体现微卫星位点的遗传变异程度，数值越大，遗传变异程度越高，即多样性越高。该研究所用的16个微卫星位点均为高度多态性位点（PIC>0.5），每个位点平均等位基因数（Na）为20.19个，与孙成飞等的研究结果[20，22，30-31]相比，均高于这些研究的平均等位基因数，说明这些位点可提供丰富的遗传信息，可有效地用于罗氏沼虾群体遗传变异分析。

3.2 群体遗传多样性分析

等位基因数和期望杂合度是衡量群体遗传多样性常用的2个参数[32]。本研究7个群体的Na介于9.625 0～12.187 5之间，He介于0.764 4～0859 6之间。Chareontawee等研究了台湾5个养殖群体2个野生群体的遗传多样性，认为养殖群体和野生群体相似，且所有群体都显示出了相对较高的遗传变异，Na介于7.50～10.67之间，He介于064～0.73之间[16]。与该报道相比，本研究中Na和He都较高。Schneider等研究了美国、印度、以色列和缅甸4个国家7个养殖群体和2个野生群体的遗传多样性，缅甸野生群体的Na和He均为最高，印度野生群体的Na和He介于7个养殖群体值之间，9个群体的Na介于3.96～20.45之间，He介于0.579 4～0935 6之间[17]。与该报道相比，本研究的Na和Ne都处于中等水平。Nguyen Thanh等研究了中国6个养殖群体和越南2个野生群体的遗传多样性，其中1个野生群体的Na和He均为最高，另1个野生群体的Na和He介于6个养殖群体值之间，8个群体的Na介于9.666～12.000之间，He介于0.785～0.835之间[19]。与该报道相比，本研究的Na、He与其相似。Khan等研究了孟加拉国3个野生群体的遗传多样性，3个群体的Na介于9.28～957之间，He介于0.804～0.827之间[18]。与该报道相比，本研究的Na高于其Na、He。可见，与同类研究相比，本研究7个养殖群体的Na和He相对处于中等偏高的水平，与一些野生群体相当。当杂合度在0.5～0.8之间即可认为该群体具有较高的多样性[33]，本研究7个群体的期望杂合度均在0.7以上，故属较高的遗传多样性水平。7个群体的多态信息含量介于0.744 3～0.825 8之间，均高于0.5，也说明5个群体有丰富的遗传多样性。但是7个群体的观测杂合度均低于期望杂合度，表明7个群体都存在一定程度的近交现象，因而为了避免群体因进一步近交而出现衰退现象，要及时引入外来的优势群体、野生群体或选择杂合子较多的近缘群体进行育种。

3.3 群体遗传分化与遗传结构分析

基因流（Nm）是不同群体间由于个体的交换而发生基因交流的过程[34-35]，它最基本的作用是削弱群体间的遗传差异。Wright认为Nm大于1可抑制种群间的分化，本研究16个位点的Nm均大于1，均值高达3.792 1，表明群体间有较高的基因交流，遗传分化程度较低[36]。遗传分化指数分析结果表明，除泰国正大群体与江浙地区所有群体间存在中等程度的遗传分化（Fst在0.101 45～0.123 48之间）外，江浙地区6个群体间遗传分化很小，即使遗传距离最远的NTH和CF群体间Fst也仅为0.050 98，刚超过0.05。采用Evanno等人的方法进行分析计算，得到最佳K值为2，即所有样本被划分为2个理论群[37]。该Structure分析结果与根据Neis遗传距离构建的UPGMA系统树相一致，均直观表明江浙地区的6个群体为一个集群，泰国正大群体独自为一个集群。所以江浙地区的6个群体从遗传上讲实为一个群体，可能是这6个群体所在的育苗公司地理位置较近，平时存在亲虾或苗种的互相供给，所以基因交流较多，遗传差异较小。推测它们的亲本来源均与选育新品种南太湖2号有关。系统聚类树分支长度表明江浙的养殖群体和引进的泰国群体间亲缘关系相对较远，此结果与孙成飞等的研究结果[20]一致，据此可以考虑引入泰国群体与江浙地区的群体进行杂交育种，以获得杂种优势。

综上，江浙地区6个罗氏沼虾养殖群体存在一定程度的近交，群体间遗传分化很小，均拥有丰富的遗传多态性，具有良好的选育潜力和前景，但须及时引种。与泰国正大群体相比，江浙地区养殖群体的遗传多态性略低。同时，ZD群体与江浙地区的6个罗氏沼虾群体的亲缘关系较远，存在中等程度的遗传分化，因此建议在今后育种时，可考虑引入正大的罗氏沼虾个体，以增加江浙地区种群的遗传多态性，避免种质衰退。该研究不但揭示了江浙一带罗氏沼虾种质资源的遗传变异现状，而且也为罗氏沼虾育种者和生产者在罗氏沼虾种质资源保护、优良品种选育以及生产实践上提供参考。

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