GC-MS法检测左卡尼汀中遗传毒性物质S-环氧氯丙烷

王淋，李雪*，朴惠顺，李敏，段成军（.延边大学药学院，吉林 延吉 33000；.吉林省博大伟业药物研究有限公司，长春 30000）

左卡尼汀（levocarnitine）于1905年被俄国学者发现，别名左旋肉毒碱、L-肉碱，化学名为（R）-3-羧基-2-羟基-N，N，N-三甲基-1-丙胺氢氧化物，是人体细胞内的一种有效成分。正常人体中左卡尼汀的含量为0.2 ～6 μmol·g－1，其中75%的左卡尼汀来源于食物，食物中羊肉和牛肉的左卡尼汀含量最高，剩下的25%由人体合成，主要合成部位在肝脏和肾脏[1]。大约98%的左卡尼汀分布在心肌细胞和骨骼肌，左卡尼汀在临床上用于治疗慢性肾衰竭、慢性心力衰竭、冠心病，不仅有良好的疗效，而且不良反应较少，安全性较高[2-4]。国外多项研究显示适当补充左卡尼汀可显著降低冠心病的发病率、死亡率，并可能改善预后[5-6]。1993年美国食品药品监督管理局（FDA）认为其是“安全无毒”的，目前，世界上已有22 个国家在婴儿食品中加入L-肉碱，并均通过各国安全检验认证，可能出现的不良反应就是过量食用会出现暂时性腹泻，减少剂量会得到缓解[7-8]。

左卡尼汀以S-环氧氯丙烷为起始原料，经氨化、环氧化、氰基化水解制备，S-环氧氯丙烷为遗传毒性物质，需严格控制其含量。左卡尼汀每日最大日剂量为3 g，根据欧洲药物管理局发布的《遗传毒性杂质限度指导原则》相关规定，以毒理学关注阈值（TTC）限度（1.5 µg·d－1）作为基因毒性杂质的可接受限度[9]，按此计算，S-环氧氯丙烷的控制限度为0.5 µg·g－1。目前常用的S-环氧氯丙烷检测方式有气相色谱法（GC）[10]和气相色谱-质谱联用法（GC-MS）[11-12]。左卡尼汀中S-环氧氯丙烷的控制限度为0.000 05%。

1 仪器与试药

1.1 仪器

8890-7010 B 气相色谱质谱联用仪（美国Agilent 公司），BT-125D 电子天平（德国赛多利斯公司，精度：十万分之一）。

1.2 试药

左卡尼汀原料药（吉林省博大伟业药物研究有限公司，批号：20200627，纯度：98%）；S-环氧氯丙烷对照品（Toronto Research Chemicals，批号：5-CGS-95-1，供含量测定用）；二氯甲烷（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）。

2 方法与结果

2.1 GC-MS 条件

色谱柱：Agilent HP-5ms 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm）；柱温：程序升温（起始温度40℃，维持5 min；以45℃·min－1升至300℃，维持3 min）；进样口温度200℃；柱流量：1.0 mL·min－1；进样模式：分流进样，分流比为5∶1；载气：高纯氦气；检测器：质谱检测器；离子化方式：EI；离子化电压：70 eV；离子源温度：230℃；传输线温度：260℃；四级杆温度150℃；溶剂延迟：2.8 min；采集方式：选择性离子检测（SIM）；扫描范围30 ～180 amu。待测成分S-环氧氯丙烷，相对分子质量92，m/z特征离子为57和42，tR为3.744 min，质谱图见图1。

图1 S-环氧氯丙烷质谱图Fig 1 Mass spectrum of S-epichlorohydrin

2.2 溶液制备

2.2.1 空白溶剂 取二氯甲烷作为空白溶剂。

2.2.2 对照品溶液 精密称取适量S-环氧氯丙烷对照品，加入二氯甲烷将其稀释至每1 mL 中约含1 μg，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液1 mL，置于10 mL 量瓶中，加二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液 精密称取左卡尼汀2 g，置于10 mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取供试品溶液5 mL，加二氯甲烷5 mL，萃取，取下层萃取液为供试品溶液。

2.3 专属性试验

取“2.2”项下的空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各1 μL 注入GC-MS 测定，记录图谱。由图2可知，空白溶剂不干扰S-环氧氯丙烷的检测。

图2 S-环氧氯丙烷测定TIC 图Fig 2 TIC of S-epichlorohydrin

2.4 检测限与定量限

取“2.2.2”项下对照品溶液适量，加二氯甲烷逐级稀释，按“2.1”项下条件进样，测定S-环氧氯丙烷的检测限（信噪比为3∶1）和定量限（信噪比为10∶1）。结果，S-环氧氯丙烷的检测限和定量限分别为0.003 μg·mL－1和0.010 μg·mL－1。

2.5 线性关系考察

精密量取“2.2.2”项下对照品储备液0.5、0.8、1、1.2、1.4、2 mL，分别置于10 mL 量瓶中，加二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，作为线性系列溶液。精密量取上述溶液各1 μL，进样测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。结果回归方程为Y＝71.91X＋5.552×103（r＝0.996），表明S-环氧氯丙烷质量浓度在55.11 ～220.44 ng·mL－1与峰面积呈良好线性关系。

2.6 精密度试验

精密量取对照品溶液，按“2.1”项下条件测定，连续进样6 次，计算S-环氧氯丙烷峰面积的RSD值，结果RSD为5.8%（n＝6），表明该方法仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

精密量取对照品溶液和供试品溶液，按“2.1”项下条件，分别于0、2、4、6、8、12 h 进样，记录峰面积，结果显示12 h 内S-环氧氯丙烷对照品峰面积的RSD为4.0%（n＝6），左卡尼汀原料中均未检出S-环氧氯丙烷，溶液稳定性良好。

2.8 重复性试验

取左卡尼汀原料（批号：20200627），精密称定，按“2.2.3”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下条件进样分析，记录色谱图，结果显示6 份供试品均未检测出S-环氧氯丙烷。

2.9 回收试验

精密称取左卡尼汀原料（批号：20200627）适量，精密称定9 份，置于10 mL 量瓶中，分别加入“2.2.1”项下对照品储备液0.8、1、1.2 mL，按“2.2.2”项下方法制备低、中、高3 种浓度的供试品各3 份，按“2.1”项下条件进样分析，并计算回收率，结果平均回收率均＞100.0%，RSD＜8.6%（n＝3）。

2.10 样品中S-环氧氯丙烷的测定

取左卡尼汀原料药（批号：20200627、20200628、20200629），精密称定，按“2.2.2”项下方法制备3 份供试品溶液，按“2.1”项下条件进样分析，结果均未检出S-环氧氯丙烷。

3 讨论

考察甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、正己烷及二氯甲烷作为溶剂时S-环氧氯丙烷的出峰情况，结果甲醇与S-环氧氯丙烷在高温时发生化学反应，无目标峰；N，N-二甲基甲酰胺溶剂峰出峰时间晚，极易造成管路及样品污染；正己烷溶剂峰大，与S-环氧氯丙烷重叠，无法分离；S-环氧氯丙烷易溶于二氯甲烷，且分离度好，故选用二氯甲烷作为溶剂。

本方法通过各项试验验证，结果均符合要求，灵敏度高、专属性强、分析时间短、准确度较好，适用于左卡尼汀中S-环氧氯丙烷的检测。