影响猪冻精质量因素的研究进展

童世锋，李雅楠，朱墨，谢锐，刘杨 *

(1. 南京农业大学动物科技学院，江苏 南京 210095；2. 农业农村部都市农业重点实验室，上海 200240)

近年来，随着我国养猪业的迅速发展，人工授精(AI)技术已在各大规模化养猪场得到广泛应用，AI技术的使用有效提高了养猪业的生产效率，降低了生产成本。目前AI技术使用的主要是新鲜精液，且技术已相当成熟，但其存在保存时间短、运输难度大等问题，限制了AI技术的推广使用[1]。精液冷冻则有效延长了精子的体外保存时间且便于运输，扩大了精液使用的时间和空间范围，有效避免新鲜精液存在的问题，除此之外，冷冻精液还可以提高良种公畜的利用率，应用于保存种质资源、开展国际间种质资源交流等方面[2]。目前，牛精液冷冻保存技术已比较成熟，且在奶牛生产中得到全面的应用。但由于在猪精液冷冻过程中，猪精子对冷应激的敏感度较其他物种更强，低温更容易对猪精子造成不可逆的损伤，导致精子冻后活力低、受精率低，与配母猪的妊娠率低、产仔数少[3]。为降低冷冻过程中对精子造成的损伤，研究人员最开始主要采用甘油作为冷冻保护剂，有效提高了冷冻精液的质量；其后在猪精液冷冻稀释液中加入卵黄、糖类等保护剂，也被证实可以明显提高精子活力；随着对猪精液冷冻损伤机理的研究不断深入，近年来越来越多的研究表明在稀释液中添加抗氧化剂可明显改善精子的结构与功能；除了稀释剂对猪冻精质量的影响，精液稀释前的平衡时间、冷冻程序、解冻液以及解冻速率等因素都会对精子的冻后活力、活率、质膜完整性、顶体完整性和受精率等指标产生不同的影响[2,4]。

由此可见，影响猪冻精质量的因素复杂多样，但目前对其研究还不够透彻，因此更加深入地分析影响猪冷冻精液质量的因素，有利于进一步优化猪精液冷冻保存技术，提高冷冻精液的质量，继而促进养猪业更科学高效的发展。

1 猪精液冷冻损伤机理

1.1 化学损伤

精液冷冻过程中，随着温度的降低，当温度处于-5 ℃至-15 ℃时，细胞外液会先于细胞内液形成冰晶，导致细胞外的渗透压高于细胞内，精细胞内的水分由内向外流出，由此引起细胞严重脱水、电解质失衡、脂蛋白变性以及膜融合等，对精细胞造成不可逆的化学损伤[2-3]。

1.2 物理损伤

研究表明，对冷冻精液造成主要损伤的不是长时间保存于低温环境中，而是因为冷冻和解冻过程中-15 ℃至-60 ℃这个危险温区[3]。在此温区内，精细胞内由液态向玻璃态过渡，细胞内的水分形成冰晶，由于冰晶的体积增大和运动，对精子质膜、细胞器等造成机械性损伤，导致精细胞失活[5]。

1.3 氧化损伤

氧化损伤即在温度变化的影响下精子内发生氧化反应，导致精细胞内活性氧(ROS)的产量大大增多并且ROS的动态平衡被打破，ROS在精细胞内过量累积，对精子的结构和活性等造成一系列损伤[2]。研究表明猪精子质膜上多不饱和脂肪酸的含量高于其他物种，多不饱和脂肪酸更容易受到ROS的攻击产生过氧化反应，产生过量的脂类氧化物，致使精子质膜、DNA片段完整性、酶活性、精子活力等严重受损，因此猪冻精较其他物种更容易发生自身氧化损伤[5-6]。

2 影响猪冻精质量的因素

2.1 冷冻前处理

首先，采精季节会影响猪精液的可冻性，研究表明冬春季节采集的猪精液冷冻后活力显著高于夏秋季节采集的精液[7]。公猪射精过程中不同部分精液也会表现出不同的可冻性，富精子部分精液冻后活力显著高于其他部分，并且前10 mL冻后质量最佳[8]。由于猪精子膜具有高蛋白/磷脂比和低胆固醇/磷脂比的特性，猪精子对低温的敏感度更高，也更容易造成精子冷休克，调整冷冻前的平衡时间有利于减少冷休克对精子的损伤[9]。SchäFer等[10]将隔夜运输20 h后的猪精液在17 ℃分别保存2 h和24 h再进行冷冻，保存2 h的精子解冻后运动能力明显高于保存24 h的，但随着解冻时在38 ℃孵育时间的延长，差异会消失；同时证实精液在5 ℃平衡4 h再进行冷冻，精子活力、细胞质膜和DNA片段完整性等明显高于平衡2 h、24 h和48 h的精液。Wasilewska等[11]发现猪精液在10 ℃保存24 h后再进行冷冻保存，精子质膜完整性、活力等高于17 ℃保存2 h的精液，这一发现有可能改善猪精液冷冻技术。

此外，冷冻前不同的离心条件对猪冷冻精液的质量也有影响。Carvajal等[12]在不同离心条件下对公猪精液进行处理分析，发现精子顶体完整率和复苏能力在2 400g离心3～5 min条件下最高，明显高于800g和400g离心相同时间，表明高转速短时间离心更有利于冷冻精液的质量。Gosalvez等[13]证实了离心管类型不会对猪冷冻精液质量造成显著影响，而离心力对其有显著作用。除离心力外，在冷冻前采用40 Mpa的静水压力处理猪精液，冷冻精液用于人工授精后母猪妊娠率和产仔数明显提高，且不会影响仔猪健康[14]。

目前，既有研究表明在猪精液冷冻时保留一部分精清能够提高冷冻精液中精子的存活率和活力，但也有研究表明精清会导致冷冻精子的功能和活力受损，射精过程中不同阶段的精清组分差异、精清的剂量对猪冷冻精液质量都会产生不同影响，因此，是否在冷冻精液中保留精清有待进一步研究[15]。近来还有研究表明精液一步恒温稀释与两步和三步分级稀释相比，一步恒温稀释的精液在冻后活力、稳定性和抗逆性等方面的表现更具优势[16]。

2.2 稀释液

猪冷冻精液稀释液主要由稀释剂、营养剂、保护剂以及其他添加剂组成，保护剂的主要成分为缓冲物质、电解物质、冷冻保护剂、抗氧化剂和抗菌物质等。稀释液中的每一成分都会对冷冻精液的质量产生影响。

2.2.1 冷冻保护剂

甘油是目前最常用的一种渗透性冷冻保护剂，可以渗透到猪精子细胞内，与细胞内的水发生水合反应，减少冰晶的形成，从而减轻冰晶对精细胞的物理损伤，有效地保护冷冻精液。当前研究表明在稀释液中添加2%～3%的甘油，精子的活力和顶体完整率最高，过高浓度的甘油对精子有毒害作用[17]。此外，甘油还被证明在猪精液冷冻过程中具有抗凋亡作用，抑制精细胞的凋亡[18]。马丽等[19]在稀释剂中添加不同浓度的二甲基亚砜(DMSO)以及不同比例的甘油和DMSO混合液，研究其对猪冷冻精液的保护效果，结果表明添加60 mL/L的DMSO和30 mL/L的DMSO与甘油3∶1混合液，精子的质膜完整率、顶体完整率显著提高。刘宏等[20]研究表明在稀释剂中添加5%的二甲基甲酰胺(DMF)，能够代替稀释液中的甘油，具有较好的猪精液冷冻保护作用。卵黄也是常用的冷冻保护剂之一，胡传活等[21]在稀释液中添加不同比例的卵黄，对比分析表明猪精液冷冻稀释剂中添加20%的卵黄，能够较好地维持精子的顶体完整性和活力。Bathgate等[22]通过比较不同类型的卵黄对猪冷冻精液的保护效果，发现鸡卵黄的保护效果优于鸭卵黄和鹌鹑卵黄。卵黄作为猪精液冷冻保护剂的主要有效成分是低密度脂蛋白，能够较好地保护精子细胞膜。张伟[23]研究表明用8%的低密度脂蛋白代替稀释液中20%的卵黄，精子的顶体完整率显著提高。

糖类作为非渗透性保护剂，能够调节精细胞外的渗透压，防止精细胞过度脱水，从而有效提高猪冷冻精液的质量。杨升等[24]研究表明在传统的ZO稀释液(Zorlesco)基础上添加4%水苏糖能够显著提高冷冻精子的活力、顶体完整率以及质膜完整性，并表明水苏糖与甘油共同作用能够更有效地提高猪冻精质量。Gómez-fernández等[25]对比了在稀释液中添加3种单糖和5种双糖对猪冷冻精液质量的影响，结果表明3种单糖中葡萄糖对猪冻精的保护效果最好，5种双糖中海藻糖对猪冷冻精液的保护效果显著高于其他双糖，且海藻糖的保护效果优于葡萄糖。潘红梅等[26]探究了不同双糖组合对猪冷冻精液质量的影响，结果表明以66.7%的蔗糖和33.3%的乳糖组合添加于稀释液中，精子的活力、顶体完整率等显著高于其他组合。总之，多项研究都表明了葡萄糖[25]、蔗糖[25-26]、乳糖[25-26]、海藻糖[25]和海带多糖[27]等多种糖类都有效提高了冷冻-解冻后猪精子的活力和受精率。

2.2.2 抗氧化剂

抗氧化剂能够有效减少精子质膜上的不饱和脂肪酸受到ROS攻击而产生的过氧化反应，保护质膜的完整性和功能，显著提高猪冷冻精液的质量。近年来对抗氧化剂的研究越来越深入全面。Lee等[28]在稀释剂中添加10 mmol/L烟酸(NA)，精子脂质的过氧化反应明显降低，改善了冷冻-解冻后猪精子的质膜完整性，表明NA对猪精子质膜的保护有显著作用。Namula等[29]研究表明在猪精液冷冻过程中添加100 μmol/L的绿原酸(CGA)和咖啡酸(CA)可以显著提高精子活力、存活率和质膜完整性。Trzcińska等[30]比较了不同浓度的还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及3种抗氧化剂的不同浓度组合在猪精液冷冻过程中的抗氧化作用，结果表明在稀释液中添加单一抗氧化剂时，添加5.0 mmol/L GSH精子活率最高；SOD和CAT联合使用能显著提高解冻后精子活率。此外，研究还发现合适浓度的γ-谷维素[31]、α-硫辛酸[32]、芹菜素和阿魏酸[33]等多种抗氧化剂都能有效提高猪冷冻精液的质量。除了常用抗氧化剂外，还有部分糖类如红景天多糖也被证实可以在猪精液冷冻过程中增强抗氧化能力，显著提高精子的活率、质膜完整率，有效改善猪冷冻精液的质量[34]。

2.2.3 抗菌物质

在采精和精液冷冻过程中精液经常会被细菌污染，导致精子活力严重下降，在稀释剂中添加抗菌物质能有效减少细菌污染对猪冷冻精液的危害。青霉素和庆大霉素等抗生素都被证实可以有效减少17 ℃保存时细菌对精子的危害[35]。Brya等[36]在稀释液中添加几种不同浓度比例的抗生素，通过对比分析表明100 g/mL庆大霉素和100 g/mL氟苯尼考联合使用，可有效提高15 ℃保存的猪稀释精液的精子活力、膜完整性和受精率等。近年来，为避免冷冻精液中大量使用抗生素使细菌产生耐药性，抗生素替代品的研究也越来越广泛。已有研究表明抗菌肽(PMAP-37、PBD1和PBD2等)具备替代猪精液稀释剂中抗生素的潜能[37-38]。

2.2.4 缓冲物质

精子代谢会使精液的pH值发生变化，对精子产生危害，在猪冻精稀释液中添加柠檬酸钠、磷酸二氢钾等缓冲物质能调节至适宜的pH值，从而达到提高冷冻精液质量的效果[2]。当稀释剂pH值为8左右的弱碱性时，猪冷冻精液解冻后精子质量明显提高[39]。Namula等[40]为探究Tris缓冲液对冷冻-解冻后猪精液质量的影响，在稀释液中加入不同浓度的Tris缓冲液调节稀释液的pH值，结果表明在稀释液中添加24 μmol/L的Tris缓冲液，解冻后精子的活率、质膜完整率显著高于其他浓度的试验组，但不同浓度的Tris缓冲液对精子顶体完整率的影响不显著。

2.3 冷冻程序

2.3.1 冷冻温度和速率

猪精液冷冻保存通常是在-196 ℃的液氮中保存，精液从新鲜精液的温度降至液氮温度的过程中，需跨越-5 ℃至-60 ℃的危险温区，危险温区就会对精子造成不可逆的损伤。已有研究表明，猪精子的临界温度为12 ℃，当温度低于临界温度时，就会发生冷休克，损伤精子质膜和顶体膜，导致精子活力下降[41]。因此，为了在猪精液冷冻过程中有效避开危险温区对精子的损伤，需采用一个合适的冷冻速率。冷冻速率过快或过慢会造成不同程度的物理和化学伤害。梁鸿斌等[42]通过比较3种不同的冷冻速率对猪精液冷冻质量的影响，研究表明采用-120 ℃熏蒸10 min精子的顶体完整率和质膜完整率显著优于其他2种速率。另还有研究表明不同的入氮温度对猪冻精精子活力的影响差异不显著，但随着入氮温度的降低精子活力呈上升趋势[43]。

2.3.2 冷冻剂型

不同剂型或同一剂型不同规格的冷冻保存形式都对猪冷冻精液的质量产生影响，目前常用的冷冻剂型有颗粒型、细管型、塑料或铝箔袋型，而目前研究使用最多的是细管型，细管型又分为0.25 mL、0.5 mL及5 mL的规格。刘德玉等[44]比较了不同规格细管对猪冷冻精液质量的影响，结果表明0.5 mL细管保存的冻精解冻后精子活力最高，顶体完整率最高的为5 mL细管，使用0.25 mL细管会出现公猪品种效应。薛琦[45]也证实了0.5 mL细管保存的猪冻精的精子活力显著高于0.25 mL，且当采用液氮熏蒸时，距离液氮液面1.638 cm的熏蒸效果显著优于距离液面2.162 cm，精子活率明显提高。

2.4 解冻程序

猪精液的解冻过程同样也需要跨越危险温区，解冻液以及解冻的温度和速率都会对猪冷冻精液的质量产生影响，合适的解冻液、解冻温度及解冻速率能有效提高解冻后精子的活力和受精率。Yamaguchi等[46]在猪冻精解冻液中添加咖啡因和CaCl2，解冻后的精液用于母猪的人工授精，母猪的妊娠率、产仔率明显提高，但产仔数之间的差异不显著。随后在解冻液中添加咖啡因被进一步证实可以明显提高猪冻精解冻后精子的运动力，且对精子的顶体完整率无影响，同时表明解冻液中咖啡因的添加可以减少母猪子宫炎症的发生[47]。在解冻液中添加适量的载脂环糊精(CLC)，精子质膜完整率和顶体完整率会显著提高，但过量的CLC会导致精子活力下降[48]。Gadani等[49]则表明在解冻液中添加不同剂量的白藜芦醇(Res)或表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)不会损伤猪精子的活力和顶体完整率，并且添加2 μmol/L Res、25 μmol/L或50 μmol/L EGCG可显著提高受精率。

胡传活等[43]评估了3个不同解冻温度(37、50和70 ℃)对解冻后猪精子活力的影响，结果表明3个解冻温度对冻后活力的影响不显著，但冻后活力有随温度上升而提高的趋势。梁鸿斌等[42]研究表明，37 ℃水浴解冻30 s 0.25 mL细管保存的猪冷冻精液，精子的活力、质膜完整率最高。殷方芝等[50]在探究猪冷冻精液5 mL细管保存效果的影响因素时，发现不同解冻温度及时间对猪精子冻后活力影响不显著，但42 ℃ 40 s解冻后精子顶体完整率最佳。

3 问题与展望

20世纪70年代以来，随着Beltsville法和Westendorf法2种猪精液冷冻方法的建立，猪精液冷冻技术已经取得重大进步，但目前猪冻精主要用于种质资源的保护，在人工授精上的应用效果还远不及新鲜精液的应用效果[3]。未来随着在影响猪冷冻精液质量因素上的研究更加深入完善，将从根本上提高猪冷冻精液质量，猪冷冻精液也将会在精液长期保存、猪人工授精、提高养猪业生产效率、加快优质品种育种进程、种质资源保护及交流等方面发挥至关重要的作用。