犬子宫内膜基质细胞的分离培养与鉴定

倪珺，雷诗敏，罗丽平，谢国玉，刘序，芮荣

(南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095)

子宫疾病是危害犬类健康与繁殖性能的临床常见疾病，严重者甚至威胁生命。近年来，我国宠物行业发展迅速，宠物犬饲养数量不断增加，犬的健康日益受到宠物主人的重视。众所周知，大多数子宫病变均与激素失调和细菌感染有关，而母犬生殖生理特点使其更易受微生物感染，引发生殖系统疾病[1]，其中子宫蓄脓发病率较高、危害较大，不及时治疗可能引发母犬死亡，研究犬子宫内膜细胞的变化对阐明子宫疾病的发病机制具有重要意义。培养犬子宫内膜基质细胞，可为了解犬子宫内膜病变过程中基质细胞的生长代谢、相互作用和内分泌调控等提供有益的体外模型，国内有关犬子宫内膜细胞的分离培养鲜有报道。本试验旨在通过优化基质细胞的分离培养程序，以期提高犬子宫内膜基质细胞体外培养的纯度和成功率，为进一步探讨犬子宫内膜相关疾病的发病机制提供有价值的体外细胞模型。

1 材料与方法

1.1 子宫组织样本的来源

2018年9月至2019年12月从南京数家宠物医院采集2～8岁进行子宫卵巢摘除术的健康犬子宫，摘取的子宫样本立即放入4 ℃含双抗(100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)生理盐水中，2 h内送达实验室进行分离培养操作。

1.2 主要试剂

DMEM/F12培养基、胎牛血清购自Gibco公司；Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、台盼蓝均购自美国Sigma公司；100×青霉素-链霉素溶液购自Biosharp公司。鼠抗人波形蛋白(vimentin)抗体、鼠抗人细胞角蛋白(cytokeratin-18，CK-18)抗体购自北京Bioss公司。

1.3 犬子宫内膜基质细胞分离及原代培养

1.3.1 子宫组织样本的处理

在超净台内无菌操作，先将子宫样本移至灭菌烧杯中，剪除子宫周围结缔组织和脂肪，用含双抗生理盐水冲洗子宫外部血液等。冲洗干净后，移至另一洁净无菌平皿中，从一侧子宫角沿子宫外壁纵向剖开，暴露子宫内腔，将内膜面展平在无水乙醇中浸泡30 s。PBS冲洗除去乙醇，用眼科镊剥离子宫内膜，放入含PBS小玻璃瓶中，剪成约1 mm3组织块。PBS清洗血液至液体清亮。

1.3.2 胶原酶消化处理

剪碎的组织块移至10 mL离心管，1 000 r/min离心5 min，除去上清后加入3倍组织体积的不同浓度Ⅰ型胶原酶(分别为0.5%，0.25%和0.125%)，摇匀后置于37 ℃培养箱中消化30 min至4 h，为使消化液与组织密切接触，每隔10 min取出震荡1次。组织消化完毕后加入适量DMEM/F12培养基稀释，反复吹打悬液，分别经100目、400目细胞网筛滤去未消化的组织和上皮细胞团块。收集滤液1 500 r/min 离心10 min，弃上清，所获细胞沉淀即为基质细胞。用适量10% FBS DMEM/F12培养液悬浮细胞，台盼蓝计数以(3～5)×105个/mL密度铺于细胞瓶中，轻轻摇晃均匀，置于38.5 ℃，5% CO2培养箱中培养。24 h后换新鲜培养液，除去未贴壁组织细胞，之后每2 d换液1次。

1.4 犬子宫内膜基质细胞的传代培养与纯化

与上皮细胞相比，基质细胞在传代过程中更易被胰蛋白酶消化脱壁，再次贴壁也更快。根据这种特性，采取差时贴壁法在传代培养时纯化细胞。倒置显微镜下观察细胞生长状态，原代犬子宫内膜基质细胞生长3～4 d铺满瓶底即能进行传代；细心倒去旧上清培养液，用预热38.5 ℃ PBS洗3次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶溶液(含0.02% EDTA)，轻轻晃动细胞瓶，使酶溶液与细胞面充分接触。显微境下观察细胞变化，直至大部分成纤维样细胞收缩变圆后，立即加入等量完全培养基(含10% FBS)终止消化，收集消化液1 000 r/min 离心5 min，沉淀重悬，按3×105个/mL细胞密度移入新的细胞培养瓶扩增培养，培养箱中培养3 h后大部分基质细胞已贴壁，弃去上清培养液，添加新鲜培养液，即可得到进一步纯化的基质细胞，CO2培养箱中静置培养，用作细胞观察与鉴定。

1.5 犬子宫内膜基质细胞的观察与鉴定

1.5.1 基质细胞的显微镜观察

倒置显微镜下每天观察细胞不同阶段的生长状态和记录其形态学特点。

1.5.2 免疫荧光化学鉴定细胞表型及纯度

在6孔培养板中放入圆形玻片，P3代犬子宫内膜基质细胞接种于上述培养板中，细胞爬片培养2～3 d至几乎全部覆盖玻片，PBS小心清洗2次，用4%多聚甲醛常温固定30 min。PBS吹打洗涤3次，0.1% TritonX-100孵育15 min，PBS洗涤3次，BSA室温封闭30 min后加入一抗(鼠抗人波形蛋白vimentin的工作浓度为1∶200，鼠抗人细胞角蛋白CK-18的工作浓度为1∶200)，4 ℃过夜，滴加Cy3标记的羊抗鼠二抗(工作浓度为1∶100)，避光室温孵育1 h。DAPI复染细胞核10 min。抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察并采集图像。每张细胞片低倍镜下随机选取10个视野计数细胞。

1.6 MTT检测基质细胞增殖情况

每隔3代(P3、P6、P9、P12)用MTT法检测犬子宫内膜基质细胞的增殖状况并绘制细胞生长曲线。96孔板内接种细胞(1×105个/mL)，设置6个复孔，于38.5 ℃，5% CO2的培养箱中静置培养8 d。每天观测细胞生长状态并采用MTT法检测，读取各孔在波长570 nm处的OD值。以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.7 冻存前后基质细胞存活率测定

将冻存前和解冻后的细胞制成细胞悬液，加入等体积0.4%台盼蓝染色3 min，混合均匀取10 μL沿盖玻片边缘滴入血球计数板小室，显微镜下观察计数。活细胞透亮，死细胞因细胞膜通透性改变而被染成蓝色。随机选取视野，分别记录细胞数，计算活细胞占细胞总数的百分比即为细胞活率。

1.8 数据统计与分析

采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析处理，P<0.05表示差异显著，数据以“平均数±标准误”表示。

2 结果

2.1 不同浓度胶原酶的细胞消化效果

剪碎组织中加入不同浓度的胶原酶Ⅰ置于37 ℃培养箱作用一段时间，观察组织的消化程度。结果发现，0.125%胶原酶Ⅰ作用1 h，液体轻度浑浊；作用2 h，组织边缘飘出絮状物；作用4 h左右时，组织几乎酶解，液体为稀糊状，易于过滤。0.25%胶原酶Ⅰ作用1 h，组织开始疏松；作用2 h左右，组织全部被酶解，液体较黏稠，较难过滤。0.5%胶原酶Ⅰ作用30 min，组织疏散成絮状；作用1 h时组织已被酶解，液体呈糊状，黏度高，难过滤。每隔10 min振荡消化液，根据消化状态灵活把控消化时间，3种酶浓度都可获得活力较好的细胞。因体外分离细胞的过程较长，为节约试验时间，选用0.5%Ⅰ型胶原酶消化培养60 min左右，消化完毕的消化液加入适量DMEM/F12稀释，以便于网筛过滤。

2.2 基质细胞培养成功率与细胞产量

试验成功分离培养出犬子宫内膜基质细胞，培养成功率较高，但从宠物医院运输到实验室时间较久的样本分离培养的细胞存活率低或极易发生污染。试验发现，处于不同发情状态的母犬子宫分离得到的基质细胞也有差异。绝大多数做绝育手术的母犬处于发情期，子宫角细长，子宫内膜潮红，内腔黏液较少，其原代分离培养得到的基质细胞易贴壁生长，细胞产量高。间情期的母犬子宫松弛，子宫角较粗，剖开后内腔黏液较多，原代分离培养得到的基质细胞状态不佳，不易贴壁，污染几率较高，常常导致分离培养失败。母犬发情期和间情期子宫经原代分离培养所获基质细胞平均活率测定结果见表1。

表1 母犬不同生理阶段子宫原代分离的基质细胞平均活率%

由表1可见，原代培养24 h和48 h后，分别对发情期和间情期的犬子宫内膜基质细胞进行活率检测，结果表明发情期的犬子宫经原代分离培养所获的细胞活率均显著高于间情期(P<0.05)。

2.3 基质细胞形态学和生物学特征

原代培养的犬子宫内膜基质细胞接种3 h左右开始贴壁，12 h基本贴壁完全，以(3～5)×105个/mL密度接种3 d接近铺满。倒置显微镜下观察显示，培养24 h的犬子宫内膜基质细胞开始延伸生长，细胞薄而扁平，多数细胞呈三角型或星型(图1A)；48 h时细胞伸长为梭形或放射状，胞浆丰富而透明(图1B)。

A.培养24 h(400×); B.培养48 h(100×)

用添加0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液作细胞传代培养，消化的最适作用时间为3 min，此时可见大部分梭形细胞收缩脱壁。传代后的基质细胞形态不变，生长迅速(图2A)，48 h左右基本汇合，细胞之间平行排列或呈漩涡状分布(图2B)。随着传代次数的增多，基质细胞的纯度也越来越高，但12代之后细胞逐渐生长缓慢，至19代时细胞几乎不再生长。

A.培养24 h(200×);B.培养48 h(100×)

2.4 基质细胞的免疫荧光鉴定

将CK-18和vimentin 2种特异性标志分子对体外分离的犬子宫内膜基质细胞进行免疫荧光染色，即可判定细胞表型及纯度。结果表明，传代的基质细胞多呈长梭形，以vimentin染色阳性(胞浆内见红色荧光标记)，CK-18染色阴性(胞浆内无或弱绿色荧光标记)，证实培养的细胞为基质细胞(图3)。Vimentin阳性细胞率为(93.10±0.59)%，分离的基质细胞纯度在92%～95%。

图3 犬子宫内膜基质细胞的免疫荧光鉴定(比例尺=50 μm)

2.5 基质细胞生长曲线的绘制

犬子宫内膜基质细胞生长曲线呈现“S”型，接种后有1 d适应期，P3、P6、P9代细胞在培养第2天进入指数增长期，5 d以后细胞逐渐减少；P12代细胞推迟1 d进入指数增长期，细胞生长缓慢，由此可见，随着传代次数增多，犬子宫内膜基质细胞的增殖能力逐渐下降。P3、P6、P9细胞生长速率基本接近，处于增殖旺盛阶段，符合正常的分裂增殖特性。

图4 犬子宫内膜基质细胞的生长曲线

2.6 基质细胞冻存前后的存活率

分别解冻P3、P6、P9代细胞，检测冻存前后的细胞活率见表2。P3、P6、P9代细胞冻存前均有较高的存活率，解冻后P9代细胞存活率相比前两者显著降低(P<0.05)。

表2 犬子宫内膜基质细胞冻存前后的平均细胞活率 %

3 讨论

犬与其他哺乳动物有着不同的生殖生理特点，卵泡在发情排卵后逐渐黄体化，血液中雌激素水平下降，孕酮水平逐渐增加，并且体内的高浓度孕酮一直会持续到间情期[2]。有研究表明，母犬发情后期和间期升高的孕酮含量和降低的雌激素含量会引起子宫内膜腺囊性增生，并影响其白细胞抗感染能力[3]，蓄积的腺体分泌物和低下的自身免疫力造成了利于细菌繁殖的子宫内环境，这意味着母犬比其他动物更容易感染子宫疾病。子宫内膜主要是由基质细胞和上皮细胞组成，而增生期的子宫内膜以基质细胞为主[4]。为研究基质细胞的生理功能，本试验优化了犬子宫内膜基质细胞分离培养程序，为研究子宫原位的作用机制、分析细胞间相互联系及细菌的侵袭过程、研究性激素的调节作用等提供了理想的细胞模型。

绝育母犬的子宫组织离开体内后，易受到外界细菌的污染而可能导致培养失败，因此取材必需在手术过程中无菌获得，并保持低温运输尽快送达实验室。试验发现，发情期子宫样本较间情期样本所获细胞原代培养更易贴壁，生长状态更好，间情期子宫样本原代培养过程状态不佳，且容易发生污染。据报道，人子宫内膜基质细胞易受到阴道细菌污染而导致培养失败[5]，奶牛处于间情期的子宫分离培养所获内膜细胞活力较低[6]。这一发现推测与间情期雌性体内异常的性激素水平有关，导致细胞大小、形态及特性发生变化或子宫免疫功能降低而未能清除内膜上入侵的细菌。本试验所取内膜多为发情期内膜，内膜基质细胞含量更高，为降低间情期子宫内膜分离培养的失败率，适当增加了洗涤液及培养液中的青霉素、链霉素浓度，以最大程度减少污染。

本试验对犬子宫内膜基质细胞的分离培养参考人[7]和各种动物的研究方法[8-12]，并对宗振平等[13]和Bartel等[14]的方法加以摸索和改良。目前，子宫内膜的分离主要采用酶消化法，酶的种类、浓度、作用时间因动物不同、细胞不同而异，酶消化法又分胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法和混合酶消化法。前期经过多次试验发现，胰蛋白酶对犬子宫内膜消化效果较差，消化时间短则组织块未被完全消化，时间长则液体十分黏稠，难以过滤，且对细胞作用强、损伤大，得到的细胞量很少，而用胶原酶对细胞的影响较小，获得的细胞易分散、活力更强，因此试验直接用胶原酶持续消化。本研究用0.125%、0.25%、0.5%Ⅰ型胶原酶分别对组织作用消化，观测消化时间和消化效果，结果发现，0.125% Ⅰ型胶原酶也可取得较好的消化效果，且消化液易于过滤，但需消化4 h以上； 0.5% Ⅰ型胶原酶在较短的时间内可获得了较多的细胞，且不影响细胞的活性；0.25% Ⅰ型胶原酶的消化效果处于两者之间。此外，需要把控好组织与消化酶的体积比(1∶3)，尽量剪碎内膜组织可减少消化酶作用时间，防止因消化酶添加过多或组织量大加长消化时间而导致过度消化，从而影响细胞的活力和贴壁情况。由于子宫内膜基质细胞分离培养步骤较多，操作时间较长，对细胞存活易产生不良影响，为了缩短细胞在体外的分离时间，减少污染概率，试验选择0.5% Ⅰ型胶原酶，对黏稠的消化液适当稀释以便于更快过滤，增加活细胞的比例。

网筛过滤法是一种常用的组织细胞分离法[8，15]，根据上皮细胞体积大且易成团而基质细胞体积小且易贴壁的特点，采用100目和400目细胞筛网过滤去除未被消化组织和腺上皮细胞团，滤液离心即可获得较纯的基质细胞悬液，以较高的密度接种可增加细胞间的相互支持，降低培养失败的概率。再根据原代上皮细胞和基质细胞的贴壁时间差异进行二次分离纯化，腺上皮细胞贴壁时间较长，一般36 h后才可以首次换液，因此接种细胞24 h时需及时换液以除去上皮细胞，提高基质细胞的纯度。依然混杂在基质细胞中的上皮细胞，可根据两者对胰蛋白酶的敏感性不同，采用多次差时消化法纯化出基质细胞，即使还有少量的腺上皮细胞也会因为不能耐受传代而被除去。

试验分离得到的犬子宫内膜基质细胞呈成纤维细胞样，传代细胞的生长速率比原代细胞快，第2天即进入对数生长期。P9代之前基质细胞增殖能力较强，冷冻后也有较高的存活率，细胞稳定性好，可在体外生长至19代。犬原代细胞的分离培养过程不改变细胞特异性蛋白的表达，因而可采用针对基质细胞抗原的特异性抗体对细胞进行免疫鉴定。许多学者认为细胞角蛋白只在腺上皮细胞中特异性表达，vimentin在基质细胞和腺上皮细胞中均可表达，因此，仅vimentin不能作为鉴别基质细胞与上皮细胞的依据[16-18]。利用角蛋白和波形蛋白抗体检测和计数分析表明，试验培养的离体细胞确为基质细胞，可以达到92%～95%的细胞纯度，可用作进一步的试验研究。

子宫内膜基质细胞是激素作用的靶器官，其分泌功能也十分复杂[19]。Wang 等[20]对人子宫内膜基质细胞进行全基因转录组分析，发现基质细胞经孕酮处理会促进免疫细胞群募集和血管生成，这对于成功怀孕至关重要；子宫内膜基质细胞分泌的甲状旁腺激素相关蛋白可以作用于骨骼、肾脏等器官，有助于钙的传送[21]。子宫内膜基质细胞还可以表达大量细胞因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、集落刺激因子(CSF1)、肿瘤坏死因子α (TNFα)等[22]，这些生长因子可维持机体的正常生命活动。研究发现孕酮可通过增强成纤维生成因子(FGF)的表达使小鼠子宫内膜基质细胞G1期延长,在此期间如果受到合适的介质刺激即开始分化[23]；犬子宫内膜基质细胞受大肠杆菌和脂多糖刺激后，细胞因子IL-8、CXCL5和CXCLl0分泌增加，对炎性部位嗜中性粒细胞和T淋巴细胞的募集发挥重要作用[18]。因此子宫内膜基质细胞同细胞因子的关系极为密切。

子宫内膜细胞在体内受内分泌环境等多种因素的调节，妨碍了对单一细胞的关键性分析。因此，体外分离纯化具有同一性的子宫内膜基质细胞是研究其生长代谢、激素作用以及免疫机理的重要环节。本试验优化了细胞分离步骤，提高了细胞产量，对犬繁殖生理与疾病的研究具有重要意义，为研究犬子宫内膜相关疾病提供了理想的细胞模型。