日粮添加碳酸氢钠对湖羊生长性能、瘤胃发酵参数和细菌菌群的影响

梅士俊，曾洪波，金巍，毛胜勇

(南京农业大学消化道微生物实验室，江苏 南京 210095)

在现代集约化养殖条件下，为满足消费者对肉制品不断增长的需求，实现养殖利润的最大化，肉羊企业逐步使用全混合颗粒日粮替代传统全混合日粮。与传统全混合日粮相比，颗粒化全混合日粮可充分利用地源性农副产品等非常规饲料资源，更便于大规模生产运输储存，还可缩减规模化养殖条件下的人工成本，提高养殖企业的经济效益[1]。因此，全混合颗粒饲料在肉羊养殖业中得到了大量应用。但是，颗粒化日粮的使用也引起了一些营养健康问题。例如，由于颗粒化日粮在制粒过程会促进淀粉糊化，这在一定程度上提高了日粮在瘤胃中的发酵速度[2]，增加了动物发生瘤胃酸中毒的风险[3]。同时，颗粒料还导致日粮中物理有效中性洗涤纤维的含量下降，降低咀嚼次数、反刍时间和唾液的分泌量，从而进一步影响瘤胃内环境的稳态[4]。

碳酸氢钠是一种相对安全、价格低廉的强碱弱酸盐，在动物体内可解离为碳酸氢根，增加机体的碱贮从而缓解瘤胃酸中毒状况，其还能在一定程度上提高畜禽生长性能以及抗热应激的能力。Hu等[5]研究显示，奶牛日粮中添加碳酸氢钠可显著提高干物质采食量、乳脂率以及乳脂产量。Xu等[6]和Khorasani等[7]研究发现，泌乳后期奶牛日粮中添加碳酸氢钠可提高4%乳脂校正乳的产量。Cruywagen等[8]研究表明，奶牛日粮中添加0.8%的碳酸氢钠可降低瘤胃pH值小于5.5的时间、丙酸的摩尔比例以及乳酸的浓度。日粮中添加一定比例的碳酸氢钠可以提高反刍动物的生产性能，增加企业的经济效益。

然而，目前尚不清楚在使用全混合颗粒料日粮这种新的肉羊饲养模式下，使用碳酸氢钠是否具有改善肉羊瘤胃健康的作用。为此，本文选用育肥期湖羊为研究对象，研究了高精料全混合颗粒饲料中添加碳酸氢钠对湖羊生长性能、瘤胃发酵和细菌菌群结构的影响，为阐明碳酸氢钠在肉羊饲料配方中的合理应用提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲养管理

试验于2018年12月19日至2019年1月24日在江苏省徐州苏羊羊业有限公司进行。选用健康的3月龄育肥期湖羊16头，平均体重(29.00±2.87) kg，随机分为2组，每组8头，每组4个重复，每个重复为2头，各重复饲养于同一栏中。其中：对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中添加0.5%的碳酸氢钠(南京致润生物科技有限公司)。2组日粮均制成全混合颗粒料，基础日粮营养水平参照《肉羊饲养标准(NY/T816—2004)》[9],详见表1。预饲期5 d，正试期30 d。每天饲喂2次(8:00和16:00)，自由采食和饮水。试验期间，每日的剩料量控制在采食量的10%左右，每日记录采食量。试验开始和结束时，对各组羊分别进行称重。

表1 基础饲粮组成成分及营养水平(绝干基础)

1.2 样品采集

试验结束后，分别从每个重复中随机挑选1头羊，于当天晨饲后4 h屠宰采样，采集瘤胃内容物装入高温灭菌的5 mL离心管，存储于-20 ℃冰箱用于后续提取微生物DNA。另取部分瘤胃内容物，经四层纱布过滤，一部分过滤所得的瘤胃液立即测定pH值，另一部分瘤胃液装入5 mL离心管，-20 ℃冰箱冷冻保存，用于挥发性脂肪酸的测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 瘤胃液样品中挥发性脂肪酸的测定

瘤胃液样品中挥发性脂肪酸浓度的测定参照文献[10]的方法。

1.3.2 瘤胃微生物DNA提取

瘤胃微生物的DNA提取参照文献[11]。采用CTAB结合酚-氯仿-异戊醇法提取。使用NanoDrop ND-2000(Thermo Fisher Scientific，USA)测定DNA浓度和纯度，保证提取的样品DNA的OD260/280在1.80～2.00之间，保存DNA样品于-80 ℃冰箱备用。

1.3.3 细菌16S rRNA基因的高通量测序及数据分析

对细菌16S rRNA基因的V3-V4区进行PCR扩增，引物序列为341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。扩增产物利用Illumina MiSeq PE250平台进行测序(凌恩生物科技有限公司，上海)。

高通量数据分析参照文献[12]，利用QIIME软件(1.9.0版)进行。利用UPARSE在0.03水平上聚类OTU[13]，α和β多样性分析在序列深度28 482上进行。基于Unweighted UniFrac Metric进行主坐标(PCoA)分析[14]。基于SILVA 数据库(Release13.2 http://www.arb-silva.de)对OTU的代表性序列进行系统分类[15]。

1.4 数据统计与分析

所有试验数据经过Excel(2016)初步整理后，生长性能数据结果使用SPSS 22.0软件中GLM模型进行统计，瘤胃发酵数据采用独立样本t检验进行统计分析，瘤胃微生物数据结果使用SPSS 22.0软件中的Kruskal-Wallis H(K)非参数检验进行差异分析。P<0.05表示差异显著，0.05≤P≤0.10表示有变化趋势，P>0.10表示差异不显著。

2 结果

2.1 添加碳酸氢钠对湖羊生长性能的影响

如表2所示，与对照组相比，日粮中添加碳酸氢钠显著提高了湖羊平均日增重(P<0.05)，总增重和平均日采食量有增加的趋势(P<0.10)，料重比有下降的趋势(P<0.10)。

表2 添加碳酸氢钠对湖羊生长性能的影响

2.2 添加碳酸氢钠对湖羊瘤胃发酵参数的影响

如表3所示，与对照组相比，试验组瘤胃pH值显著提高(P<0.05)，总挥发性脂肪酸浓度显著降低(P<0.05)，乙酸浓度有降低的趋势(P<0.10)，其他挥发性脂肪酸浓度无显著差异(P>0.05)。乙酸比例、丙酸比例、丁酸比例和乙酸/丙酸无显著差异(P>0.05)。

表3 添加碳酸氢钠对湖羊瘤胃发酵参数的影响

2.3 添加碳酸氢钠对湖羊瘤胃细菌菌群结构的影响

2.3.1 湖羊瘤胃细菌菌群的测序深度分析

由图1可知，稀释曲线趋于平缓，表明测序深度和数据量充足，能够覆盖大多数菌。

图1 所有样本的稀释曲线

2.3.2 湖羊瘤胃细菌菌群的多样性分析

如表4所示，与对照组相比，添加碳酸氢钠对湖羊瘤胃细菌的α多样性指数无显著影响(P>0.05)。PCoA分析的结果显示，两组样品没有被明显区分开来，暗示添加碳酸氢钠对瘤胃细菌菌群结构的影响较小(图2)。

表4 添加碳酸氢钠对瘤胃细菌菌群α多样性的影响

图2 瘤胃细菌菌群结构的主坐标成分分析

2.3.3 门水平细菌丰度变化

由表5可见，全部样品共检测出15个门，2个组的优势菌群均为厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门，这3个门的相对丰度均在5%以上。与对照组相比，试验组中TM7菌门相对丰度有上升的趋势(P<0.10)，其他门的相对丰度无显著差异(P>0.05)。

2.3.4 属水平细菌丰度变化

由表6可得，相对丰度大于1%的属有23个。2个组的普雷氏菌属、未分类瘤胃球菌属、丁酸弧菌属和瘤胃球菌属相对丰度均在5%以上。与对照组相比，试验组未分类韦荣氏菌科的相对丰度显著降低(P<0.05)，未分类克里斯滕森菌科的相对丰度有上升的趋势(P<0.10)，其他属的相对丰度无显著差异(P>0.05)。

表5 添加碳酸氢钠对瘤胃细菌门水平相对丰度的影响

表6 添加碳酸氢钠对瘤胃细菌属水平相对丰度的影响

2.3.5 OTU水平细菌丰度变化

由表7可得，相对丰度大于1%的优势OTU有28个。对照组中相对丰度>2.0%的OTU有：OTU2(4.30%, 普雷沃氏菌属, 拟杆菌门)、OTU8(3.73%, 瘤胃球菌属, 厚壁菌门)、OTU7(3.69%, 普雷沃氏菌属, 拟杆菌门)、OTU15(3.21%, 普雷沃氏菌属, 拟杆菌门)、OTU5(2.15%, 丁酸弧菌属，厚壁菌门)、OTU3(2.11%, 未分类瘤胃球菌属,厚壁菌门)、OTU12(2.09%, 未分类BS菌属, 拟杆菌门)。试验组中相对丰度>2.0%的OTU有：OTU1(5.68%, 普雷沃氏菌属, 拟杆菌门)、OTU2(3.58%, 普雷沃氏菌属, 拟杆菌门)、OTU5(2.59%, 丁酸弧菌属, 厚壁菌门)、OTU11(2.56%, 瘤胃球菌属, 厚壁菌门)、OTU3(2.12%, 未分类瘤胃球菌科, 厚壁菌门)、OTU4(2.09%,丁酸弧菌属，厚壁菌门)。与对照组相比，试验组的OTU24(0.07%, 解琥珀酸菌属, 厚壁菌门)的相对丰度有降低的趋势(P<0.1)。

表7 添加碳酸氢钠对湖羊瘤胃细菌优势OTU相对丰度的影响

3 讨论

碳酸氢钠作为一种饲料添加剂，已在畜禽饲料中得到广泛的应用。研究发现，奶牛日粮中添加碳酸氢钠，可提高其干物质采食量[16]、产奶量[16-17]和乳脂含量[18]。但是目前关于在全混合颗粒料日粮条件下添加碳酸氢钠对肉羊生长性能影响的研究较少，本文添加0.5%的碳酸氢钠显著提高了育肥期湖羊的平均日增重，提示在全混合颗粒日粮条件下添加适宜水平的碳酸氢钠有助于提高湖羊的生长性能。

反刍动物日粮中非结构性碳水化合物如淀粉含量过高或者饲草粉碎过细，瘤胃发酵过快，pH值迅速降低，进而可能诱发瘤胃酸中毒。同时较低的pH值会导致纤维降解率降低[19]。本文中瘤胃pH值低于5.8，暗示湖羊可能处于亚急性瘤胃酸中毒状态。添加0.5%的碳酸氢钠虽然升高了pH值，但升高的幅度较小，pH值仍然处于较低水平，在这一瘤胃环境条件下，纤维降解很可能会受到抑制。有研究报道，奶牛日粮中添加碳酸氢钠缓冲液改变了瘤胃挥发性脂肪酸谱，提高了乙酸浓度，降低丙酸浓度，提高乙酸丙酸比[20]，其原因可能是碳酸氢钠升高了瘤胃pH值，促进了纤维降解利用，导致乙酸生成量增加。本文中添加0.5%的碳酸氢钠未改变瘤胃挥发性脂肪酸谱，这可能与纤维降解利用受到抑制有关。

瘤胃微生物菌群组成和结构对维持内环境的稳态至关重要。本试验结果显示，添加碳酸氢钠使瘤胃中未分类韦荣氏菌科的相对丰度显著降低，未分类克里斯滕森菌科的相对丰度有升高的趋势。Golder等[21]发现韦荣氏菌科的相对丰度与母牛瘤胃中乳酸浓度呈正相关。Stewart等[22]报道，韦荣氏菌科中的某些属能够利用乳酸。因此，未分类韦荣氏菌科可能与瘤胃中乳酸利用有关。de Nardi等[23]研究表明，克里斯滕森菌科微生物的相对丰度随母牛瘤胃pH值的降低而升高。这与本次试验所得的结果不一致，具体的原因有待进一步研究论证。同时在属水平和OTU水平上，两组之间存在显著差异的微生物属和OTU也极少。这些结果说明，在本试验采用全混合颗粒料日粮饲喂条件下，添加碳酸氢钠并未导致湖羊瘤胃微生物的组成、结构及多样性指数发生显著变化。导致这一结果的原因可能与2组湖羊瘤胃pH值均低于5.8有关。相关研究表明，瘤胃pH值处于5.8以上，瘤胃微生物菌群结构相对平衡，瘤胃处于健康状态[24]；当瘤胃pH值低于5.8时，瘤胃微生物菌群结构处于失衡状态[25]。本试验中，2组湖羊瘤胃pH值均处于5.8以下，说明本试验条件下，添加的碳酸氢钠对瘤胃微生态失衡并没有起到改善作用。这些结果也进一步说明，导致肉羊生长性能改善更可能与瘤胃pH值提高有关，与瘤胃微生物菌群的变化之间可能无直接相关。

4 结论

综上所述，全混合颗粒料日粮添加0.5%碳酸氢钠可提高育肥期湖羊的生长性能，提高瘤胃pH值，但对瘤胃细菌菌群的结构和组成影响较小。