急性肾损伤实验室诊断的研究进展

蔺晨雨，肖漓 , （1. 河北北方学院，河北 张家口 075000，.中国人民解放军总医院第八医学中心呼吸与危重症医学部研究所，北京市器官移植与免疫调节重点实验室,北京 100091）

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是指由外科手术、循环血量低灌注、药毒性、烧伤外伤等原因引起的肾脏功能迅速衰退，导致氨代谢产物体液堆积，电解质紊乱、酸碱平衡紊乱并引起全身各种并发症的急重临床综合征［1］。AKI 的发生机制涉及多个方面，其中缺血、炎症、溶血、氧化应激、胆固醇栓塞和内源性或外源性毒素等多种病理状态均与其密切相关。近年来，AKI 在临床的发病率逐年增高，且病死率高、预后差，严重威胁着人类健康，已经成为突出的社会公共卫生问题，我国也深受AKI 治疗与预后的困扰。因此预测和诊断AKI 成为学者们研究和关注的热点。本文就目前临床应用的几种AKI实验室诊断标志物的研究现状和应用前景进行综述。

1 尿量和血清肌酐

目前尿量和血清肌酐（serum creatinine，Scr）水平是AKI 的预测、诊断和评估的传统实验室指标，根据改善全球肾脏病预后组织（Kidney Disease：Improving Global Outcomes，KDIGO）发布的《KDIGO急性肾损伤临床实践指南》［2］， AKI 表现为Scr 水平升高和/或尿量减少。尿量和Scr 这两项指标主要用来评估肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）短期内的变化。相对来说，尿量敏感性要高于Scr，尿量监测简单便捷，在AKI 早期，肾功能迅速衰退，GFR 下降明显，尿量速减少，甚至出现少尿无尿；而Scr 水平的升高在AKI 发生后数小时才能监测到。但尿量监测受到患者自身以及标本收集等方法学的影响较大，存在诊断局限性；单独用Scr评估受患者年龄、体重、性别和排泌等多方面的影响，Scr 改变仅在肾脏严重损伤（肾功能减退约50%及以上）后才有意义，Scr 评估肾小球滤过功能诊断AKI 时，会在临床中漏诊部分病例，用于AKI 的诊断既不敏感也不具体，所以它不是最理想的诊断指标［3］。所以尿量和Scr 用于评估肾损伤和衰竭的严重程度均有一定局限性，目前临床上常常联合监测尿量变化和SCr 水平用以预测和诊断AKI 的发生。

2 AKI 诊断的新型生物标志物

近年来，更多研究聚焦于AKI 生物标志物，用于AKI 早期筛查与监测，以便尽早采取预防和干预措施来改善患者预后［4］。目前，在AKI 患者的血液和尿液样本中发现了多种新型的生物标志物，这些AKI 新型生物标志物监测到AKI 发生的时间较Scr要提前12 ～ 48 h，也能够检测AKI 的不同病因以及不同发展阶段，有助于AKI 的鉴别和分级，可以解决尿量和Scr 作为诊断指标时延迟、敏感性不足以及不够具体等局限性，并能够指导临床在最佳治疗时机采用针对性的干预措施来改善AKI［5-6］。

2.1 血液中的AKI 生物标志物：目前已知的AKI 生物标志物种类丰富，针对目前最具临床意义的几种血液中的AKI 生物标志物，对其作为早期诊断标志物的生物学功能、研究现状及应用前景对比总结，见表1。

血液中的AKI 生物标志物浓度受到年龄、体重、性别和其他干扰因素的影响较小，且对炎性因素敏感性高，是较为理想的内源性AKI 生物标志物，但由于排泌和生理功能等因素的限制，其单独应用时具有一定局限性，这些标志物的联合检测可以更有效提高诊断与鉴别AKI 的敏感性与特异性，使其更具临床价值。

2.2 尿液中的AKI 生物标志物：近年来对于AKI 生物标志物的研究大多数集中在尿液中的标志物，尿液检测无创快速，有利于临床中反复观察、动态监测；且蛋白尿是检测肾功能的敏感指标。尿蛋白、尿miRNA、尿外泌体等生物标志物的发现和研究，更是为AKI 的早期诊断与治疗提供了新方向与新思路。

2.2.1 尿液中蛋白类AKI 生物标志物（表2）：肾损伤患者尿液中常常存在多种低分子量蛋白，这些蛋白作为检测标志物，是早期诊断AKI 的重要途径。针对目前最具临床意义的几种尿液中蛋白类AKI 生物标志物，对其作为早期诊断标志物的生物学功能、研究现状及应用前景对比总结。

表1 AKI 早期诊断的4 种血液生物标志物的比较

表2 AKI 早期诊断的6 种尿液蛋白类生物标志物的比较

NGAL、KIM-1、Cys C 等尿液中的蛋白类生物标志物，亦可在血液中检测到并作为AKI 的早期诊断标志物，此外还有许多尿液血液均可检测到的标志物，比如钙卫蛋白（calprotectin，CP）和穿透素-3（PTX3）等。脓毒症并发AKI 患者的血CP 和尿CP的受试者工作特征曲线下面积分别为0.655 和0.833，AUC（血CP）＜AUC（尿CP），提示诊断AKI 时尿CP 作为检测指标更有意义［41］。在饶楚炳等［42］的研究中发现血清和尿液PTX3 均可以作为有效指标和独立预测因素（均P ＜0.05），对危重症患者近期AKI 的发生进行及时准确地预测。其中血清和尿液PTX3 预测AKI 发生的AUC 分别为0.875，0.868。针对此类尿液血液均可检测AKI的早期诊断标志物，考虑到尿标本易获取而且无创，临床应用价值更高。

2.2.2 尿microRNA：microRNA（miRNA）是最具特征性的非编码RNA，组织特异性强，在物种之间高度保守，能抑制蛋白质翻译或诱导信使RNA（mRNA）的降解，反复冻融后仍可以在血液、尿液和其他体液中稳定存在，且易于检测。已有研究表明，miRNA 在细胞、组织和生物体从发育到死亡的生理过程中起着至关重要的作用，此外，miRNA 还参与包括肾脏疾病在内的病理生理过程，因此，miRNA作为AKI 潜在的标志物和治疗靶点在近十年来已成为研究的热点［43］。研究显示，miR-192、-194、-215、-216 和miR-204 等miRNA 在人类肾脏中富集，miR-449c-5p、-449b-5p 和-449a 在肾脏中高表达，miR-21、miR-30 家 族、miR-34a、miR-92a、miR-107、miR-125b、miR-205、iR-210、miR-494 等 与AKI 相关，这些miRNA 参与了AKI 凋亡、缺血/再灌注损伤修复、应激反应、血管生成和纤维化修复的表达调控，与AKI 密切相关［44-49］。miR-21 通过抑制细胞凋亡来减轻肾脏的缺血/再灌注损伤，在AKI 患者的尿液中高表达，但miR-21 表达范围广，在哺乳动物的肾脏以及心脏和肺组织中均表达，故作为AKI 标志物的特异性较低［44］。在AKI 的大鼠模型以及心脏手术后AKI 的患者中，miR-30 家族的下调导致足细胞损伤，其中尿miR-30c-5p 可以作为AKI 早期诊断的标志物［45］。miR-107 被证实参与了几个在AKI 中至关重要的通路，包括应激反应和血管生成，并在感染性AKI 患者的循环内皮细胞中高表达［46］。miR-125b 作为多个器官的缺血/再灌注损伤的保护因子，与 AKI 密切相关，有望成为缺血性AKI 的早期诊断标志物［44］。尿miR-182-5P 是患者移植术后AKI 的调节因子，尿miR-182-5p 的检测对移植术后AKI 的早期诊断有特异性［47］。尿miRNA 在 AKI 的发生、发展和预后中发挥关键作用，具有成为稳定、特异、敏感的AKI 早期诊断标志物的巨大潜力，细胞和组织特异性miRNA 的鉴定将为改善患者生存质量铺平道路，也将为临床医生提供真正的靶向治疗方法。

2.2.3 尿外泌体：外泌体（exosomes）是一种纳米级外囊泡，具有脂质双分子层膜结构，大小为30 ～150 nm，它由多囊泡体（multivesicular body，MVB）与质膜融合后通过胞吐作用由细胞分泌到胞外。外泌体来源广泛，尿液、血液、脑脊液、唾液、胆汁、腹水、胸水、母乳、羊水等体液中均可检测、提取出外泌体；间充质干细胞、尿路干细胞等不同类型的干细胞也可以分泌外泌体［50-52］。有学者研究表明外泌体的合成与分泌涉及到几乎所有肾脏细胞结构，且在肾脏的生物信号传递中发挥重要作用，如外泌体内容物中发现了在近曲小管和集合管之间传递信号的水通道蛋白-2（AQP-2）。最近的研究调查了从肾单位不同部分分泌的尿外泌体的组成及其与肾脏疾病的肾脏生理和病理生理的相关性［50，53］。目前为止，发现外泌体内容物中包含种类繁多功能各异的蛋白质和活性遗传物质，这使外泌体拥有多种不同的生物学功能，如维持细胞内稳态、跨膜信号传递、物质转运和抗原提呈等［54-57］。

尿外泌体作为AKI 致病分子、生物标志物和治疗化合物的来源而受到广泛关注。尿外泌体有望成为一个准确、敏感、特异的AKI 诊断的理想标志物，它完整的膜性结构使其内容物稳定性高，避免了内容蛋白受微环境中其他蛋白的污染和各种酶的降解，因此尿中外泌体标志物相比尿液中其他标志物也更加稳定。所以，尿外泌体生物学标志物在AKI 的早期诊断与治疗中更理想更优越［58］。在缺血/再灌注诱导的AKI 动物模型中，尿外泌体中的水通道蛋白-1（AQP-1）和水通道蛋白-2（AQP-2）的mRNA 水平降低［59-61］，水通道蛋白水平的降低可能影响肾单位的水处理，并可能反映AKI 的进行性发展。顺铂诱导AKI 的研究中，AKI 动物尿外泌体中钠氢交换体及AQP-1 和AQP-2［60-61］在AKI早期表达水平显著下降，较传统检测指标钠排泄分数及尿视黄醇结合蛋白而言，尿外泌体中钠氢交换体及AQP-1 和AQP-2 敏感性和特异性均更高；同时尿外泌体中胎球蛋白-A［59，62］、活化转录因子3［63-64］和足细胞骨架巢蛋白［65］高水平表达，比传统的实验室AKI 诊断标志物SCr 提前18 ～ 48 h 发生显著改变。

外泌体中的生物标志物除上述几种外，亦包含前文总结的其他标志物，如NGAL、miRNA 等， 近年研究发现尿外泌体 NGAL 与移植肾功能有关，可作为肾移植预后的指标［66］；不同的外泌体miRNA可作为脑缺血/再灌注AKI 进展分级的生物标志物，例如：在早期脑缺血/再灌注AKI 发生时即可在尿外泌体中检测到miR-16、miR-24 和miR-200C，而在缺血/再灌注的晚期则可以检测到miR-125 和miR-351［60］。以上研究表明，尿外泌体为肾脏疾病的诊断和治疗提供了新的思路和靶点，但尿外泌体AKI 标志物的大量相关研究均是在动物模型中进行的，这些结果需要在临床实践中得到进一步验证。

2.3 其他潜在生物标志物：近年来研究表明，除上述生物标志物外仍有很多颇具临床前景的标志物，比如可以帮助定位诊断肾损伤的肾脏结构损伤标志物：尿N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶（UNAG）、丙氨酸氨基肽酶（AAP）、γ 谷氨酰转换酶（γ-GT）等［15，67］。吴昱等［68］的研究还介绍了实验研究中可能有潜在意义的生物标志物，比如精脒/精胺乙酰转移酶、角质形成细胞趋化因子、半乳凝素3、肠三叶因子、尿调蛋白等，这些生物素参与AKI 的诊断与修复，但作用机制尚不明确还有待进一步深入研究。

3 生物标志物的多种联合应用

AKI 病因复杂，多种病理生理机制相互作用，各种致病因素相互影响，加之肾损伤的阶段不同、严重程度不同、发生部位不同，单一检测指标并不能及时准确的提示和诊断AKI 的发生［7，69-70］。近年来研究显示，Ang-2 与PCT 联合检测对早期诊断脓毒症AKI 具有很高的敏感性与特异性［8，12］；在监测急性心衰患者的AKI 发生时， NGAL、Cys C 和KIM-1 联合检测的AUC 要比单独应用其中任何一项指标的AUC 都高［71］；KIM- 1 和 IL- 18 联合检测诊断AKI 较其他生物标志物及组合更有效［30，72］；转铁蛋白（TRF）+微量白蛋白（mAlb）+尿视黄醇结合蛋白（RBP）+α1-微球蛋白（α1-MG）四联检测诊断肾移植术后AKI 价值最高［73］。因此，联合多个生物标志物对AKI 进行预测、诊断和预后有更好的临床实用价值［69，74］。这种方式对预判 AKI 患者的发病原因、严重程度、疾病进展以及发病部位均有较高敏感性，但费用高，对患者的经济能力要求高。

4 展 望

AKI 是院内病死率增加的独立危险因素，临床实践中迫切需要更好、更具体的诊断和治疗方案，AKI 的实验室诊断也随着对其标志物研究的逐步深入取得越来越多的进展，正朝着标准化、精确化稳步迈进。但AKI 标志物在诊断的敏感性及特异性方面尚显不足，尽管已经有许多研究致力于开发生物标志物来监测肾功能并早期诊断AKI，但很少有检测方法可以从研究领域转移到临床可实施的早期诊断与指导治疗上。在临床实践中实施生物标志物诊断预警的道路充满了障碍，新的生物标志物作为临床实践中的实施标准仍然具有挑战性。AKI 领域的研究是动态的，标志物的变化也很快，我们期望随着精准医学时代的到来，外泌体、基因工程和干细胞技术的飞速发展，生物学标志物谱和人类基因图谱的结合研究应用，可以使生物标志物检测用于常规的临床实践，使AKI 的诊断与治疗成为真正的精准医疗。