基于高通量测序白及根部内生真菌的物种组成分析

邓文祥赵漫丽王自林李永梅

（1.云南农业大学资源与环境学院，云南 昆明 650201；2.云南农问农业科技有限公司，云南 昆明 650201；3.云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201；4.云南城市建设职业学院，云南 昆明 651700）

白及（Bletilla striata）是地生兰科白及属多年生草本植物，茎基部具膨大假鳞茎，肉质，富黏性，生数条细长根[1]。白及用于止血，散热利湿，消肿、生肌等人体病症，是我国较为常见的中药材[2]。白及块茎已经在工业和食品等领域得到了广泛应用，其药用成分白及多糖则被广泛应用于临床医学[3]。研究表明，内生真菌在兰科植物整个生长史中有着不可替代的作用：在种子萌发，水分、养分吸收，抗病，促生等领域发挥着重要作用，能够促进植株生长。同时，药用植物内生真菌在有效成分合成过程中，起着积极的诱导作用[4-5]。成熟白及种子细小，胚发育不全，且无胚乳[6]，仅依靠自身营养物质，难于在自然条件下萌发。所以外源养分对其种子萌发具有重要意义。

本研究于2009—2017年不间断对白及种子进行无菌化培养，利用实验室条件提供充足氮、磷、钾和微量元素，以及添加剂和植物生长调节剂对其进行调控，能够较好的促进白及种子无菌萌发，并能得到较为茁壮的幼苗。但在白及炼苗过程中，白及幼苗总会受到外来病原菌侵染，根部、假鳞茎与叶片结合部位出现腐烂症状，在采取化学、物理防治后，也不能有效控制该病情的发生。

近年来，国内外关于白及药理、组培、化学、资源等领域的研究较多。关于白及和黄花白及（Bletilla ochracea）内生真菌组成及多样性研究，已有少量报道[7-8]，但都是对可培养型内生真菌进行分析研究，刘准等研究表明[8]，仅对黄花白及可培养型内生真菌的多样性分析，其多样性指数往往会被低估。有关云南白及根部内生真菌物种组成和种群差异的研究报道较少，本研究旨在应用高通量测序，对白及根部内生真菌物种丰度和种群差异进行分析，深入了解云南原生境白及根部内生真菌组成和分布情况，为后续相关生防菌株资源培养与筛选提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 植株材料

供试植株主要采集于云南省楚雄市南华县缓坡灌木林下杂草丛中，该地年降雨量为823 mm，采集到不同地理位置的白及植株样品3个，HCN 1共计采集14苗，HCN 2共计采集9苗，HCN 3共计采集15苗，共采集38苗。采样过程中，同时将白及根部土壤一起采集，确保植株根系完整。楚雄市南华县位于云南中部，楚雄市西部，南华县地处低纬度高海拔地区，以北亚热带季风气候为主，兼有大陆性和海洋性气候特点，立体气候明显。据本研究调查，该采样区域自2015年至今，降雨量偏少，且降雨不均，局部干旱时有发生，植被覆盖率较其他采样区域较低。采集植株样品生境见表1。

表 1 采集植株样品生境Table 1 Physical environment of sampling sites

1.2 试验方法

1.2.1 根部表面消毒

具体包括以下步骤：1）选取健康成活植株；2）自来水流动冲洗根表面，直至去除表面附着物；3）采用国家发明专利ZL 2015101400150.7[9]进行无菌化处理，先用质量分数3‰～10‰吐温、0.1‰～2.0‰K2MnO4、1%～3% NaClO、0.1%HgCl2，各试剂依次处理1.5 min，用无菌水冲洗4～6次，再用以上4种试剂重复处理1次，最后再无菌水冲洗4～6次，处理结束后，置于无菌环境中备用。

1.2.2 基因组DNA提取

使用特定的DNA提取试剂盒（QIAGEN，德国）进行基因组DNA提取后，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

1.2.3 PCR扩增

引物：ITS3_KYO2(5′ − GATGAAGAACGYAGYRAA−3′)和 ITS4(5′−TCCTCCGCTTATTGATATGC−3′)[10]以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物进行PCR。每1个25 μL的体系包括1×PCR buffer、1.5 mmol/L MgCl2、0.4 μmol/L dNTPs、正向和反向引物各1.0 μmol/L、0.5 U KOD−Plus−Neo 酶（TOYOBO）和 10 ng 模板。PCR程序包括起始 94 ℃ 1 min，然后 30个 循环（变性 94 ℃20 s，退火 48 ℃ 30 s和 延伸 72 ℃ 30 s），最后 72 ℃5 min。每个样本进行3个PCR技术重复。

1.2.4 PCR 产物检测、纯化和定量

PCR 与 1/6 体积的 6X loading buffer 混合，使用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测。取目的条带用来回收，回 收 使 用 QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)。使 用Qubit@ 2.0 Fluorometer(Thermo Scientific)定量，最后等摩尔量混合。

1.2.5 建库和测序

建库使用 TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit，构建好的文库经过定量和文库检测合格后，使用罗宁生物科技公司的Hiseq 2500平台PE250模式测序。

1.3 数据分析

1.3.1 序列处理

使用FLASH[11]拼接双端序列。基于Barcode从reads中拆分出各样品序列。截去Barcode序列得到原始数据，然后使用Trimmomatic[12]进行质控。得到有效数据Clean Reads。

1.3.2 聚类分析

基于Usearch（http://drive5.com/uparse/）软件，使用UPARSE算法[13]在97%的一致性水平上进行OTU聚类，挑选每个OTU中出现频数最高的序列作为OTU的代表序列。使用UCLUST分类法[14]与UNITE 数据库（https://unite.ut.ee/）进行注释分析。使用MAFFT version 7 的 FFT−NS−2算法[15]将代表性序列进行多重比对。使用Fast-Tree[16]构建进化树。对各样本做均一化处理，以样品中数据量最少的为标准进行重抽样。

1.3.3 群落组成分析

使用R语言[17]进行各种数据转换。使用ggplot2包作图。使用R语言中phyloseq包提取特定分类水平的群落组成，并使用mean函数计算各组样品中各物种的均值，使用pheatmap包绘制热图。为了方便展示关注的物种分类层次、物种丰度以及样本间的比较，使用特定的物种分类树进行研究。步骤为对每个样品的物种分类结果，筛选特别关注的物种（选择最大相对丰度前10的属）进行物种分类树统计，3个样品中的特定物种分类树将进行比较分析。应用SPSS 17.0 分析各样本内生真菌丰度与采样点土壤因子的相关性。

2 结果与分析

2.1 内生真菌的系统发育分析

选取丰度排名前50的OTU进行系统发育（图1）分析，明显分为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota），置信度均大于95%。

图 1 高丰度OTU系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of the high abundance OTU

子囊菌门，在样本HCN 1和HCN 3中，Leoti omycetes、Erysiphales、Erysiphaceae的Podosphaera和Erysiphe在相近发育枝上，置信度大于95%；在样本HCN 1和HCN 3中，Eurotiomycetes、Eurotiales、Trichocomaceae、Aspergillus的Aspergillussp.在同一发育枝之上，置信度大于95%；在样本HCN 1、HCN 2、HCN 3中，Sordariomycetes、Incertae sedis、Glomerellaceae、Glomerella的Glomerella cingulata的置信度为90%；Dothideomycetes、Botryosphaeriales、Botryosphaeriaceae的Phyllosticta置信度大于95%。

担子菌门中，Microbotryomycetes、Sporidiobolales、Incertae sedis，Rhodosporidium的Rhodosporidium diobovatum和Agaricostilbomycetes、Agaricostilbales、Agaricostilbaceae、Sterigmatomyces的S. halophilus在相近发育枝上，在样本HCN 1、HCN 2、HCN 3中，置信度为89%。

2.2 内生真菌群落分布及组成分析

如图2所示，样品HCN 1、HCN 2、HCN 3中，Ascomycota丰度分别为98.48%、95.70%、96.71%；Basidiomycota丰度分别为0.51%、4.30%、1.52%。

图 2 高丰度门水平类群热图Fig.2 Heatmap of high abundance at the phylum level

如图3所示，样品HCN 1、HCN 2、HCN 3中，Dothideomycetes丰度均最高，依次分别为95.95%、93.92%、91.90%；Eurotiomycetes丰度依次为1.07%、0.51%、2.53%；Sordariomycetes丰度依次为0.25%、1.27%、1.27%；Agaricostilbomycetes丰度依次为0.51%、0.51%、0.25%；Tremellomycetes丰 度 为2.78%（HCN 2）、0.25%（HCN 3）；Leotiomycetes丰度为0.76%（HCN 1）、1.01%（HCN 3）；Agaricomycetes丰 度为1.01%（HCN 2）；Exobasidiomycetes和Microbotryomycetes在HCN 3中丰度均为0.51%。

如图4所示，在目水平上，样品HCN 1中物种丰度大小依次为Capnodiales 2.03%、Botryosphaeriales 1.77%、Erysiphales和Agaricostilbales丰度 均 为0.51%、Eurotiales 1.01%、Incertae sedis 0.25%；样品HCN 2中物种丰度大小依次为Incertae sedis 1.27%、Eurotiales 和Agaricostilbales均为0.51%，Pleosporales、Capnodiales、Botryosphaeriales、Cystofilobasidiales和Polyporales丰度均为0.25%；样品HCN 3中物种丰度依次为Botryosphaeriales 2.78%、Eurotiales 2.53%、Incertae sedis 1.27%、Capnodiales和Erysiphales丰度均是 1.01%，Pleosporales、Microstromatales 和Sporidiobolales丰度均为 0.51%，Agaricostilbales 和Cystofilobasidiales丰度均是 0.25%。

图 3 高丰度纲水平类群热图Fig.3 Heatmap of high abundance at the class level

如图5所示，在科水平上，样品HCN 1中物种丰度大小依次为Botryosphaeriaceae 1.77%、Erysiphaceae和Mycosphaerellaceae均为0.76%、Trichocomaceae和Agaricostilbaceae均为0.51%、Glomerellaceae 0.25%；样品HCN 2中物种丰度大小依 次 为Glomerellaceae 1.27%、Agaricostilbaceae 0.51%，Botryosphaeriaceae、Mycosphaerellaceae、Montagnulaceae、Cystofilobasidiaceae、Polyporaceae丰度均为0.25%；样品HCN 3中物种丰度大小 依 次 为Botryosphaeriaceae 2.78%、Trichocomaceae 2.28%、Glomerellaceae 1.27%、Erysiphaceae 1.01%、Montagnulaceae和Incertae sedis均为0.51%，Agaricostilbaceae、Mycosphaerellaceae、Cystofilobasidiaceae 丰度均为0.25%。

如图6所示，选择在属水平上物种丰度排名前50的进行排序，生成热图进行群落组成分析。样品HCN 1中各菌属丰度从大到小依次为：Phyllosticta1.77%、Aspergillus0.51%、Erysiphe0.51%、Sterigmatomyces halophilus0.51%、Podosphaera

0.25%、Glomerella cingulate0.25%；样 品HCN 2中各菌属丰度从大到小依次为：Glomerella cingulate1.27%、Sterigmatomyces halophilus0.51%、Phyllosticta0.25%；在样品HCN 3中各菌属丰度从大到小依次为：Phyllosticta2.78%、Aspergillus

1.27%、Erysiphe1.01%、Sterigmatomyces halophilus0.25%、Rhodosporidium diobovatum0.51%。

如图7所示，选择在种水平上物种丰度进行排序，样品HCN 1、HCN 2、HCN 3 中，Glomerella cingulata丰度依次为0.25%、1.27%、1.27%，Sterigmatomyces halophilus丰 度 依 次 为0.51%、0.51%、0.25%，Dothideomycetessp.丰度依次为0.51%、2.53%、0.76%；样品HCN 1中，Ascomycotasp.的丰度为0.51%；样品HCN 2中Tremellomycetessp.的丰度为2.03%；样品HCN 3中，Aspergillussp.的 丰 度 为1.01%，Rhodosporidium diobovatum的丰度为0.51%。

图 4 高丰度目水平类群热图Fig.4 Heatmap of high abundance at the order level

图 5 高丰度科水平类群热图Fig.5 Heatmap of high abundance at the family level

图 6 在属水平的高丰度热图Fig.6 Heatmap of high abundance at the genus level

图 7 高丰度种水平类群热图Fig.7 Heatmap of high abundance at the species level

2.3 特定物种分类树分析

对HCN 1、HCN 2、HCN 3 样本中丰度前10的属进行特定物种分类树分析。由图2～8可知：子囊菌门占总样本群落丰度的96.46%。是该采样点的优势菌门。担子菌门，占物种总丰度的2.11%。Sterigmatomyces halophilus占物种总丰度的0.42%，占该分类层次物种丰度的11.9%，是HCN 1、HCN 2、HCN 3 样本中共有菌属；子囊菌门，占总物种丰度的96.96%。Podosphaera和Erysiphe分别占物种总丰度的0.08%、0.51%，分别占该Erysiphaceae分类层次物种丰度的2.38%和14.29%，其中，Podosphaera是HCN 1中独有菌属，关于Erysiphe物种丰度，HCN 3高于HCN 1样本中丰度；Aspergillus占总物种丰度的0.93%，占Trichocomaceae分类层次物种丰度的26.19%，HCN 3高于HCN 1样本中丰度；Phyllosticta占总物种丰度的1.6%，占Botryosphaeriales分类层的45.24%，样品HCN 3、HCN 1、HCN 2物种丰度依次降低。

图 8 特定物种分类树Fig.8 Specific taxonomic tree

2.4 内生真菌物种丰度与土壤理化性质相关性分析

如表2所示，3个采样区域中，根部土壤pH、全碳、全氮、全磷、全钾、碱解氮、速效磷、速效钾均有一定的正负相关性。其中，HCN 1和HCN 3样品物种丰度与全氮显著正相关；HCN 3物种丰度与全磷显著负相关，HCN 2物种丰度与速效钾极显著负相关。

表 2 不同采样点根部内生真菌物种丰度与土壤因子的相关性分析Table 2 Correlation analysis of endophytic fungus species abundance and soil factors in different collection sites

3 结论与讨论

该采样区域的白及植株根部内生真菌主要是担子菌门，丰度值为2.11%，子囊菌门，丰度高达96.96%，是该区域的优势菌门。

Phyllosticta是 样 本HCN 1、HCN 2、HCN 3中丰度均在前10的物种，是高丰度菌属。有研究证明，Phyllosticta是广泛引起世界范围内植物叶枯病和叶斑病的主要致病菌，在果树上病症表现尤为突出[18]，但也有研究证明Phyllosticta capitalensis和P. paracapitalensis对P. citricarpa具 有拮抗作用[19]。Erysiphe在HCN 1和HCN 3丰度分别在0.51%和1.01%。研究发现，Erysiphe对大多植物有致病性[20]，Erysiphe中的白粉菌是常见的专性寄生真菌，能够侵染多种瓜果类农作物，并造成严重危害[21]，本研究关于白及属植物病害调查也发现，白粉病时有发生。与Erysiphe处于相近发育枝的Podosphaera也是引起植物白粉病的重要病原菌[22-24]。在样本HCN 1、HCN 2、HCN 3中的丰度均在前10的物种还有Glomerella cingulata，丰度均处于较高水平。研究表明，Glomerella cingulata对果蔬和花卉植物均具有致病性[25-29]。在兰科石斛中Glomerella也被分离出来，是石斛根部内生真菌的优势菌属[30]。Glomerella cingulata与苹果GlomerellaLeaf Spot密切相关[31]；该属对辣椒、橄榄、山茶花、雪松，苹果等植物都有致病性[25,27,29]。同时也是引起兰科植物铁皮石斛炭疽病的病原菌之一[32]。

而在样本HCN 1、HCN 3中存在的Aspergillus在植物生防领域有着积极作用[33-34]，特别是Aspergillus versicolor次生代谢产物中的吲哚−3−乙酸（IAA）和氨，促进共生植株根、茎、叶的生长[35-36]。从大豆根部分离的Aspergillus fumigatussp.LH02，能够显著增加大豆植株茎长、鲜干质量、叶面积、叶绿素含量[37]。Aspergillussp.KJ-9的7种代谢产物对Gibberella saubinetti、Magnaporthe grisea、Botrytis cinerea、Colletotrichum gloeosporioides、Alternaria solani等致病菌有抑制作用[38]。Rhodosporidium diobovatum在HXJ1和HXJ2中的丰度均为1.27%。已有研究结果表明，该菌种的代谢产物对植物促生和生防也有较好效果[39]。Rhodosporidium toruloides是一种多用途真菌，能产生生物催化剂、氨基酸、脂质等物质[40-41]，R. toruloidesY4对木质纤维素衍生的抑制剂具有较好的耐受性[42]。

担 子 菌 门 中，Sterigmatomyces halophilus在3个样本中均有分布，Antunes和Aguiar对Sterigmatomyces halophilus进行了系统性描述，并指出该菌种在生态和工业中有较好应用前景，其代谢产物在生防领域也有较好利用价值，可作为生防菌株研究利用[43]，同时Sterigmatomyces halophilus对土壤重金属有较好的吸附性，具有一定的生态修复功能[44]。

在各样本中同时有病原菌和生防菌株的存在，但植株并未见明显的患病病症。分析发现，在样品HCN 1、HCN 2、HCN 3中，Phyllosticta、

Aspergillus、Sterigmatomyces halophilus、Rhodosporidium diobovatum等菌属已经在其他植物研究中被发现具有促生和生防作用。本研究中，以上物种在属种水平上丰度总体处于优势地位，丰度高于Glomerella cingulata、Erysiphe、Podosphaera等已经被公认的致病菌丰度值。3个不同采样点白及根部组织中存在一定丰度的致病菌，同时也有较高丰度的益生真菌共存。这一结果为后续益生白及内生真菌筛选和致病菌分析提供了依据。

3个样品间的采样距离和地理位置差异是引起白及根部内生真菌组成差异的影响因子之一。不同的土壤理化性质与白及根部内生真菌物种丰度之间存在直接相关性，是白及根部内生真菌物种组成差异的主要影响因素。