脂多糖诱导星形胶质细胞炎性反应的机制研究

郭敏芳，张慧宇，穆秉桃，尉杰忠,2*，马存根,3*

（1.山西大同大学脑科学研究所，山西大同 037009；2.大同市第五人民医院神经科，山西大同 037009；3.国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点研究室/神经生物学研究中心，山西中医药大学，山西晋中 030619；）

星形胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system，CNS）中数量最多的胶质细胞，主要起支持营养神经细胞，调控神经递质循环，维持内环境稳定及支持血脑屏障等作用[1]。近年来研究发现星形胶质细胞可以调节中枢免疫反应，在多种神经免疫性疾病的病理生理过程中发挥关键作用。星形胶质细胞在神经疾病病理过程中具有两面性，即有害角色/保护角色。作为有害角色，可以通过增加血脑屏障的通透性，分泌各种炎性因子和趋化因子，抑制轴突和髓鞘再生等机制促进疾病的严重程度[2]。NO是由诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iN⁃OS）合成的，是诱导神经元损伤的特征性炎性因子，此外，炎性因子，比如肿瘤坏死因子−α（tumor necro⁃sis factor−α，TNF−α）、白细胞介素−1β（interleukin−1β，IL−1β）和IL−6等，也在神经损伤过程中发挥重要作用。体外实验证实，LPS激活的星形胶质细胞可以释放NO，多种炎性因子和趋化因子[3]。

有研究表明，星形胶质细胞表达的Toll样受体4（toll−like receptor 4，TLR4）可以识别LPS，被LPS激活的星形胶质细胞源性TLR4能触发信号级联导致核因子κB（nuclear factor−kappa B，NF−κB）炎性反应通路活化[4]，NF−κB信号通路被激活可以引起iNOS的表达，多种炎性因子和应激反应介质的释放[5]，从而参与神经变性疾病的炎性反应。

在本次试验中，我们用LPS刺激C57BL/6小鼠大脑皮质星形胶质细胞，观察由LPS触发的星形胶质细胞损伤过程是否与NF−κB通路的异常激活有关，从而探讨LPS诱导星形胶质细胞产生炎性反应及其可能机制。

1 材料和方法

1.1 材料

C57/BL6小鼠(体质量18～20 g)，购于中国医学科学院实验动物中心；ELISA检测试剂盒购自美国Pe⁃proTech公司；LPS购自美国Sigma公司；小鼠GFAP抗体、兔抗iNOS抗体、兔抗NF−κB抗体及兔抗GAP⁃DH抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；Al⁃ex Flour ®488和Alex Flour ®594标记的山羊抗兔IgG二抗、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自美国Abcam公司；蛋白提取和蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；高糖DMEM细胞培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 原代小鼠星形胶质细胞培养

新生1～2 d C57/BL6小鼠乳鼠于无菌条件下断头，分离大脑皮质，放入预冷的PBS液中，分离脑膜和血管后用巴氏滴管轻轻吹打，制成单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min；弃上清，细胞沉淀用星形胶质细胞基本培养液（含200 mL/L胎牛血清的高糖DMEM）重新悬浮，然后将细胞接种入75 cm2的培养瓶（预先用多聚赖氨酸处理）中，放入CO2培养箱中培养。10～14 d后细胞铺满瓶底。然后以180 r/min的速度在37 ℃恒温摇床中震荡5 h，去除上层的少突胶质细胞和小胶质细胞[6]。最后胰酶消化传代。

1.2.2 鉴定星形胶质细胞

用GFAP免疫荧光细胞化学染色法对纯化的星形胶质细胞进行鉴定，荧光显微镜下随机观察10～12个视野，计算GFAP阳性细胞的百分比。

1.2.3 实验分组

将纯化后的第2代星形胶质细胞以5×106/mL的密度接种于6孔细胞培养板中，24 h后更换基本培养液，实验分2组：对照组，加PBS；LPS刺激组，加入1µg/mL LPS，作用24 h后收集培养上清液用于后续实验。

1.2.4 检测上清液中NO的含量

取各组细胞培养上清液，按照试剂盒说明书操作，检测上清液中NO的含量，单位是µmol/L。

1.2.5 ELISA法检测上清液中炎性因子的水平

收集各组细胞培养上清液，采用ELISA试剂盒测定IL−6、IL−1β和TNF−α的水平，单位为pg/mL。

1.2.6 免疫荧光法检测iNOS和NF−κB的表达

LPS作用24 h后，细胞用4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗5 min × 3次，用含有0.3% Triton X−100和1%BSA的PBS封闭并通透1 h；然后加入兔抗iN⁃OS抗体(1∶500)、兔抗NF−κB抗体(1∶500)，4 ℃孵育过夜；次日加488和594标记的山羊抗兔IgG二抗，室温下孵育2 h，PBS洗5 min ×3次；用含有DAPI的抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察，并采用Im⁃age−Pro Plus 6.0图像分析软件检测iNOS和NF−κB的荧光强度值。

1.2.7 Western blot法检测iNOS和NF−κB蛋白表达

LPS作用24 h后，收集细胞，4 ℃条件下提取蛋白。蛋白定量试剂盒将各组蛋白浓度调成一致。采用10% SDS−PAGE凝胶电泳分离，转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST洗膜5 min×3次。用封闭液稀释兔抗iNOS(1∶200)抗体，兔抗NF−κB (1∶400)和兔NADPH抗体(1∶1 000)一抗，将抗体稀释液加至膜上，4 ℃孵育过夜。次日TBST洗膜5 min × 3，加山羊抗兔HRP偶联的二抗（1∶10 000），室温孵育2 h。最后用Bio−Rad凝胶成像仪检测染色条带并分析条带灰度。

1.2.8 统计学分析

实验重复3次，取平均值，采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析处理。组间比较采用t检验，P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 AST纯度鉴定结果

GFAP免疫荧光染色结果显示星形胶质细胞纯度达95%以上（图1）。

图1 星形胶质细胞的鉴定（×400）

2.2 LPS刺激对星形胶质细胞释放NO的影响

LPS刺激星形胶质细胞24 h以后，按照试剂盒说明书检测2组细胞培养上清液中NO水平。结果显示，LPS引起星形胶质细胞分泌NO明显增加，与PBS组相比，差异有统计学意义（图2）。

图2 LPS刺激对星形胶质细胞释放NO的影响

2.3 LPS刺激对星形胶质细胞释放炎性因子的影响

LPS刺激星形胶质细胞24 h以后，按照ELISA检测试剂盒说明书检测2组细胞培养上清液中IL−6、IL−1β 和TNF−α 的水平，结果显示，星形胶质细胞经LPS刺激后炎性因子IL−6、IL−1β 和TNF−α 的分泌显著增加，与PBS组相比，差异有统计学意义（图3）。

图3 LPS刺激对星形胶质细胞分泌炎性因子的影响

2.4 LPS刺激对星形胶质细胞的iNOS和NF-κB蛋白表达的影响

利用免疫荧光细胞化学染色法和免疫印迹法检测LPS对星形胶质细胞iNOS和NF−κB蛋白表达的影响，结果显示，LPS刺激24 h后，星形胶质细胞iNOS和NF−κB的表达显著升高，与PBS组相比，差异有统计学意义（图4～5）。

图4 免疫荧光法检测星形胶质细胞iNOS和NF-κB的表达（×400）

3 讨论

神经炎症在神经系统疾病的发病机理中起着非常重要的作用，包括细菌/病毒性脑膜炎在内的各种传染性疾病和非传染性疾病，包括帕金森病（Parkin⁃son's disease，PD）、阿尔茨海默病（Alzheimer's dis⁃ease，AD）和亨廷顿病（Huntington's disease，HD）等神经退行性疾病，脑外伤（traumatic brain injury，TBI）、肌萎缩性侧索硬化症（amyotrophic lateral scle⁃rosis，ALS）和中风等运动神经元疾病，多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）等神经免疫性疾病[7]。免疫系统的2个组成部分（固有免疫和适应性免疫）在多种神经系统疾病神经炎症的产生中都起着至关重要的作用。虽然小胶质细胞是CNS的固有免疫细胞，但是越来越多的证据证明星形胶质细胞是具有免疫功能的细胞，能够通过分泌炎性细胞因子和趋化因子诱发炎性反应，因此星形胶质细胞在神经炎症过程中也发挥着关键作用[8]。

图5 免疫印迹法检测星形胶质细胞iNOS和NF-κB的表达

LPS是存在于革兰氏阴性细菌外膜中的分子，是研究最深入的免疫刺激分子之一，可诱发全身性炎症。它的主要目标TLR4，通过激活TLR4募集下游的一系列衔接子，例如髓样分化因子MyD88，最终导致NF−κB的激活，进而诱导大量促炎基因的激活[9]。目前神经炎症领域的大多数研究工作都使用LPS来刺激星形胶质细胞和小胶质细胞。因此本研究也采用LPS刺激星形胶质细胞，来促发其炎性反应。

NF−κB是一种普遍存在且用途广泛的核转录因子，是体内炎症反应和氧化应激反应的关键调节剂。例如，NF−κB参与炎性因子的分泌和诱导型环氧合酶（cyclooxygenase，COX−2）的表达，而COX−2参与iNOS和花生四烯酸类物质的合成，iNOS可以增强神经胶质细胞和内皮细胞的NO生成[10]。炎性因子和NO在病理性炎症中起着不可或缺的作用，它们可导致血脑屏障的破坏，上调黏附分子表达并刺激有毒物质扩散，并且可导致兴奋毒作用，最终引起神经元的死亡，而炎性介质TNF−α 和IL−1β 反过来又可以促进NF−κB的活化，引发炎性反应的放大[11]。NF−κB是小胶质细胞的关键驱动器，小胶质细胞中NF−κB信号通路激活可以导致神经炎症，引起神经损伤，而转录组学和生化分析显示，NF−κB不仅存在于小胶质细胞中而且也存在于星形胶质细胞中[12]。由于星形胶质细胞具有与免疫相关的功能，因此推测星形胶质细胞的NF−κB信号通路激活有助于神经炎症级联反应。在本研究中，我们用1µg/mL LPS刺激星形胶质细胞24 h，然后检测炎性因子和NO的水平，实验结果表明，LPS可以促发星形胶质细胞炎性反应，引起NO的释放增加，同时，引起星形胶质细胞分泌IL−6、TNF−α和IL−1β明显增加。为了阐明其可能的机制，我们检测了NF−κB和iNOS的表达，免疫荧光和免疫印迹结果均显示，LPS可以诱导星形胶质细胞NF−κB和iNOS的表达显著增加。

综合以上实验结果，LPS刺激星形胶质细胞导致NF−κB表达增加，活化后的NF−κB进入胞核，启动炎性介质及促炎因子的转录、合成和分泌增加，从而导致神经损伤。因此，研发和使用NF−κB的特异性抑制剂，可以有效抑制CNS炎性反应，为神经炎症患者的治疗提供希望和帮助。