口腔鳞癌中FOXP3的表达及临床意义

张超杰 闫红娟 赵举红 张杰 李朝阳 徐江

1石河子大学医学院（新疆石河子832003）；2石河子大学医学院第一附属医院（新疆石河子832008）；3广州医科大学附属肿瘤医院（广州510095）

口腔鳞癌即口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，全球发病率达到40万/年［1］，近年对OSCC的筛查、诊断、治疗等方面取得了进展，许多潜在的分子标志物和靶点也被逐渐发现，但在过去的几十年里，整体5年生存率等指标徘徊在55%～65%，肿瘤的局部复发和转移是导致其预后差及生存率下降的主要原因［2-4］。深入探究影响OSCC 预后的相关因子，寻找新的肿瘤标志物及治疗靶点来提高患者的生存率至关重要。

FOXP3 是叉形翼螺旋家族成员之一，位于染色体Xp11.23 上，由11 个外显子和10 个内含子组成［5］。FOXP3 是Treg 的特异性标记分子，在调节T 细胞的形成及免疫抑制功能中起着关键作用［6］。FOXP3 在癌细胞中的表达已被证明与肿瘤生物学行为的调控有关［7］，且不同的肿瘤组织FOXP3 的表达及功能不同。在胃癌、乳腺癌中FOXP3可以作为肿瘤抑制因子，且与肿瘤较好的预后有关，而在结直肠癌中，FOXP3 可以促进肿瘤的发生与发展，但关于FOXP3与OSCC的关系尚不明确。本研究首先通过TCGA 数据库筛选出FOXP3在OSCC 中的表达情况，并与免疫组化法验证OSCC 及癌旁组织中FOXP3 蛋白的表达情况进行对比，进一步探究FOXP3 表达与OSCC 临床病理特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料纳入研究的对象为2008-2020年在新疆石河子大学医学院第一附属医院口腔颌面外科治疗的82 例男性和74 例女性口腔鳞癌患者。对纳入研究的156 例OSCC 组织制作组织芯片，并选取癌旁组织96 例作为对照组。TNM 分类的确定以第八版国际癌症控制联盟标准（AJCC）为基础［8］。收集156 例患者完整的临床病理资料，其中有随访信息102 例，随访截止日期为2020年7月30日。

1.2 TCGA数据库样本从TCGA数据库检索下载OSCC 转录组数据集375 例，其中正常组织32 例。筛选出FOXP3 表达量及临床信息，并进行统计学分析。

1.3 方法免疫组织化学染色采用EnVision 两步法，FOXP3 单克隆抗体购自ABCAM 公司，工作浓度为1∶200。肿瘤细胞中FOXP3 胞浆或（和）细胞核染色，呈棕黄色、黄褐色。免疫组织化学染色结果由2 名病理医师采用双盲方法进行评价，免疫反应积分（IRS）计算为阳性细胞百分比乘以细胞着色强度（表1）［9］。根据IRS 值，结果分为两组，其中低表达组（≤4 分），高表达（＞4 分）。组织芯片染色不典型时进行切片重复操作。

表1 免疫组化染色评分标准Tab.1 Scoring criteria for immunohistochemical staining

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0 软件对实验数据进行分析，采用χ2检验分析FOXP3 的表达其他变量的关系，Kaplan-Meier 法进行生存评估分析，生存资料中不同变量的风险比采用Cox 回归分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCGA数据库中口腔鳞癌和正常组织中FOXP3的表达差异对TCGA 数据库中OSCC 组织与癌旁正常组织样本相比，FOXP3 呈高表达（P＜0.05，图1），提示FOXP3 可能是OSCC 患者诊断的潜在标志物。

图1 TCGA 数据库中口腔鳞癌和正常组织中FOXP3 的表达差异Fig.1 The expression difference of FOXP3 in oral squamous cell carcinoma and normal tissues in the TCGA database

2.2 FOXP3 在OSCC 中表达情况及与临床病理特征的关系FOXP3 主要分布在OSCC 细胞胞浆或（和）细胞核上，呈棕黄色或黄褐色（图2）。156例OSCC 组织及96 癌旁正常组织中，FOXP3 的表达率分别为57.69%（90/156）、20.83%（20/96），两组阳性率差异有统计学意义（P＜0.001，表2），这与TCGA 数据库结果一致。患者确诊时的中位年龄为70.5 岁，平均随访3.29年。FOXP3 表达与OSCC患者T 分期、TNM 分期均相关（P＜0.05，表3）。而与年龄、性别、分化程度、淋巴结转移等均无关（P＞0.05，表3）。

表2 OSCC 及癌旁正常组织中FOXP3 的表达Tab.2 Expression of FOXP3 in OSCC and adjacent normal tissues 例

图2 FOXP3 在OSCC 中表达情况（×40；×200）Fig.2 Expression of Foxp3 in OSCC（×40；×200）

表3 OSCC 中FOXP3 表达与临床病理特征的关系Tab.3 Relationship between FOXP3 expression in OSCC and clinicopathological characteristics 例

2.3 OSCC 中FOXP3表达与患者的预后关系采用Kaplan-Meier分析FOXP3表达是否可以作为预测OSCC 预后的指标，并绘制存活曲线，检测了102 例有完整随访资料的OSCC 患者的FOXP3 表达水平与预后的关系。分析结果显示FOXP3 高表达的生存时间与FOXP3 低表达患者相比差异有统计学意义（P=0.008，图3），即FOXP3高表达组患者术后病死率更高。Cox 单因素分析显示OSCC 中FOXP3 表达量（HR= 2.32，P= 0.012）和T 分期（HR= 1.886，P= 0.031；）及TNM 分期（HR= 1.901，P= 0.032）增加患者死亡风险（表4）。Cox 多因素生存分析表明FOXP3 高表达（HR=2.415，P=0.009）与死亡有关，FOXP3 高表达是影响OSCC 患者预后的独立因素（表4）。

图3 FOXP3 表达与OSCC 患者预后的生存分析Fig.3 Survival analysis of FOXP3 expression and prognosis of OSCC patients

3 讨论

肿瘤微环境中存在CD4+CD25+Tregs，可通过与细胞直接接触或依赖相关细胞因子来一致T 细胞的免疫反应，因而不仅能维持自身的免疫耐受还能阻止机体对自体同源肿瘤细胞的免疫。FOXP3是Tregs 生长、分化及功能维持中的关键因子，可用于Tregs 细胞的测定和分离［10］，人类Treg 具有高度多样性的表型和功能，在肿瘤微环境（TME）中，Treg 被肿瘤重新编程，可获得激活的表型和抑制功能的增强，但Tregs 细胞中FOXP3 的缺失或突变可能会导致可能导致高比例的肿瘤形成［11］。一系列研究发现，在乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌和食管鳞癌中FOXP3 的表达与肿瘤的恶性程度有关，可能是由于Tregs 细胞阻止活化的CD4+、CD25+和CD8+细胞增殖，减轻对肿瘤抗原的免疫反应［12］。在胰腺癌中［13］，FOXP3 阳性的胰腺癌细胞能够抑制活化T 细胞的增殖及相关因子的表达分泌，能够介导免疫抑制和肿瘤的免疫逃逸。

本组实验发现，FOXP3 在OSCC 组织中的表达率为57.69%、癌旁组织中的表达率20.83%，且两者差异有统计学意义与TCGA 数据库结果一致，提示FOXP3 在OSCC 的发生、发展过程中可能有一定的促进作用。前期在胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和食管鳞状细胞癌中研究发现［14-15］，FOXP3 的表达与肿瘤转移相关。如在卵巢癌中，FOXP3 可以抑制癌细胞的增殖、迁移及侵袭；乳腺癌中，FOXP3 通过下调CD44 的表达来抑制癌细胞的转移［16］；在大肠癌中，KUWAHARA 等［17］发现FOXP3阳性表达与肿瘤侵袭性相关。侵袭和转移是恶性肿瘤的两大特征，是涉及多种信号传导途径及多种因素的复杂过程，FOXP3 在不同的肿瘤组织中发挥的作用不同，这与肿瘤的恶性程度及进展密切相关［18-20］。但目前，关于FOXP3 的表达与OSCC患者的临床病理关系较少，SONG 等［21］等发现FOXP3 与OSCC 患者的临床分期和淋巴结转移有一定的相关性。本组结果表明，FOXP3 的表达与OSCC 患者的T 分期及临床分期显著相关，且随着T 分期及临床分期的增加，FOXP3 的高表达率显著增强趋势，提示FOXP3 可能在OSCC 的侵袭和转移中发挥作用，但其具体机制尚不清楚。

表4 COX 单因素及多因素分析Tab.4 COX single factor and multiple factor analysis

对本研究中纳入的患者进行随访后用Kaplan-Meier 法对两组患者的生存率分析比较显示，FOXP3 高表达组患者的术后生存时间明显低于低表达组，同时对OSCC 患者预后的影响因素进行Cox 回归分析，单因素回归分析显示，FOXP3 表达量和T 分期及TNM 分期均是影响OSCC 患者预后的危险因素。多因素分析表明，FOXP3 的表达量是影响患者预后的独立因素，且FOXP3 表达量与患者的生存时间密切相关，FOXP3 表达越高，患者预后越差，提示FOXP3 可能是潜在的预后标志物，相似的在舌鳞状细胞癌［22］和口下咽鳞状细胞癌［9］患者中，FOXP3 高表达与总体生存率低相关。以上表明，FOXP3 的表达与OSCC 患者的术后生存时间密切相关，对患者的预后有重要意义。

综上，本组实验研究发现FOXP3 在OSCC 中高表达，且与OSCC 患者的预后显著相关。但还需要大量临床资料及长期随访信息结合相关分子生物实验进一步验证，目前关于FOXP3 在OSCC 发生发展中扮演的作用以及在相关免疫细胞及肿瘤微环境相互作用中调节转移行为需要更深入的研究进行探讨。