厨余垃圾高效降解菌的筛选及降解特性研究

（浙江农林大学环境与资源学院 浙江杭州 311300）

《杭州市生活垃圾管理条例》 将生活垃圾划分为可回收物、易腐垃圾、有害垃圾和其他垃圾4 类，其中易腐垃圾的有机质含量很高，资源化潜力很大。厨余垃圾作为易腐垃圾的重要组成部分［1］，并不适用于目前常用的焚烧、填埋等处理方法，这些常规的处理方法不仅浪费了资源，而且容易对生态环境造成破坏，因此应该从源头减少厨余垃圾排放。使用家用厨余垃圾处理机——利用微生物将厨余垃圾降解成有机肥料，成为了目前处理厨余垃圾最简单、方便、高效、彻底的方法，同时处理后的有机肥料可以作为植物的养料，实现了资源化的目的，研究前景十分广阔［2-3］。本实验通过筛选厨余垃圾高效降解菌种并研究其降解特性，目的是筛选出高效降解菌株。同时，研究菌株的耐盐性，对菌株降解餐厨垃圾具有指导意义，可以省去除盐的前处理步骤。

1 材料与方法

1.1 材料：培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5 g；蛋白胨10 g；NaCl 5 g；琼脂粉20 g；蒸馏水1 000 mL；pH7.2～7.4。

淀粉培养基：蛋白胨10 g/L；可溶性淀粉2 g/L；牛肉膏5 g/L；NaCl 5 g/L；琼脂20 g/L；pH 7.0～7.2［4］。

脂肪培养基：蒸馏水1 000 mL；蛋白胨10 g；牛肉浸膏5g；NaCl 5 g；香油或花生油10 g；中性红（体积分数为1.6%的水溶液）15 mL～20 mL；琼脂20 g；pH7.2［5］。

蛋白质培养基：蒸馏水1 000 mL；脱脂奶粉50 g；可溶性淀粉10 g；酵母膏5 g；KH2PO41 g；Mg SO4·7H2O 0.2 g；琼脂20 g；pH 7.0～7.2［4］。

纤维素培养基：MgSO40.25 g/L；K2HPO40.50 g/L；CMC-Na 1.88 g/L；刚果红0.20 g/L；琼脂16.00 g/L；明胶2.00 g/L；pH 7.0［6］。

上述培养基分别装入锥形瓶并放入高温灭菌锅120 ℃条件下灭菌20 min，倒平板备用。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株筛选

取1 g 市售腐熟剂溶于10 mL 蒸馏水中，充分混合后移取1mL 溶液加入9mL 无菌水中，重复上述步骤制成10-1至10-8共计8 个浓度梯度。用紫外灭菌后的移液枪移取适量菌液到平板上，用三角涂布棒进行涂布，每个浓度涂布2 块，待涂布完成后，将平板倒置放于恒温黑暗新专家和省专家确立划定高、中、低三种不同关注度。的平板上划线提纯，划线3 次，以确保挑取的菌株是单菌落。上述过程共筛得3 株形态差异且能产生水解圈的菌株，命名为TS-1、TS-2 和TS-3。

1.2.2 菌株的生长曲线

将3 个菌种分别划线到平板中，置于黑暗恒温培养箱中，在30 ℃条件下过夜培养后刮取适量菌种到无菌的5 mL 牛肉膏液体培养基中作为母液，30 ℃恒温震荡培养24 h 后移取0.5 mL 母液到装有50 mL 牛肉膏液体培养基的锥形瓶后，转移到恒温震荡培养箱中，转速为120 r/min。放入培养箱的时间记为0 时刻，每隔2h 取2mL 菌液于OD600 处测定菌液的吸光度，直到菌液吸光度保持稳定。

1.2.3 在4 种培养基中的水解圈以及菌落直径测定

将3 种菌株分别划线到平板中并置于黑暗30 ℃恒温箱中培养48 h，用牙签挑取单菌落点接于4 种大分子有机物培养基中，每个培养基中点接3 个点。48 h 后对菌落以及周围水解圈的形态特征进行观察，淀粉培养基中的水解圈需滴加革兰氏碘液才能显现。

1.2.4 菌种酶活性测定

将3 个菌种分别划线到平板中，置于黑暗恒温培养箱中，在30 ℃条件下过夜培养后刮取适量菌种到5 mL 牛肉膏液体培养基中，将其放入30 ℃、120 r/min 的恒温震荡培养箱中培养24 h 后移取0.5 mL 菌液到各种子培养液中，种子培养液在相同条件下培养48 h 后作为母液用于酶活性测定［7］。

（1）淀粉酶活性测定。种子培养液：淀粉10 g；蛋白胨5 g；蒸 馏 水1000 mL；K2HPO42 g；NaCl 1 g；CaCl20.1 g；MgSO4·7H2O 0.1 g；高压灭菌锅中121 ℃条件下灭菌20 min［8］。

淀粉酶活力采用DNS 法测定，操作步骤如下：母液离心处理后，吸取2 mL 上清液，加入2 mL DNS 试剂后40 ℃水浴加热5 min，反应完成后将液体定容至25 mL，取2 mL 液体，在OD520 处测定吸光值。将1 mL 酶液每分钟生成1 μg 麦芽糖需要的酶量定义为1 个淀粉酶活力单位。用麦芽糖溶液浓度绘制标准曲线［7］，见图1。

图1 麦芽糖标准曲线

（2）脂肪酶活性测定。种子培养液：NaNO32 g；MgSO4·7H2O 0.3 g；NaCl 10 g；橄榄油20 g；CaCl20.3g；NH4Cl 0.3 g；蒸馏水1000 mL；高压灭菌锅中121 ℃条件下灭菌20 min；pH 7.0［9］。

所需试剂：2%聚乙烯醇；0.0667 mol/L 的KH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液（pH7.0）；95%乙醇；0.1 mol/L NaOH 标准溶液（现配）；橄榄油；10 g/L 酚酞指示剂。

底物溶液的配制：将50 mL 橄榄油加入到150 mL 2%聚乙烯醇溶液中，置于离心机中预处理3 min 作为底物溶液。

取100 mL 锥形瓶3 个，标记为A、B、C。A 作为空白组，B、C 作为实验样品组，取4 mL 底物溶液和5 mL 磷酸缓冲液分别加入3 个锥形瓶中，往空白组中加入15 mL 95%乙醇后水浴预热5 min。3 个锥形瓶中分别加入1 mL 待测酶液（空白组中加入的乙醇会使待测酶液中的脂肪酶立即失活），混合均匀后水浴预热，10 min 后向B、C 瓶中各加入15 mL 95%乙醇终止反应。每个瓶中滴加酚酞试剂3～5 滴，水解产生的游离脂肪酸采用0.1 mol/L NaOH 标准溶液滴定。脂肪酶活的计算公式为：

式中：X 表示样品的脂肪酶活，U/mL；B 为样品组滴定所需NaOH 标准溶液的量，mL；A 为空白组完成滴定所需的NaOH标准溶液的量，mL；n 为实验中待测酶液的稀释倍数［10］。

（3）蛋白酶活性测 定。种子培养 液：K2HPO47.0 g/L；KH2PO42.0g/L；MgSO4·7H2O 0.2 g/L；干酪素4.0 g/L；酵母膏6.0 g/L；NaCl 0.5 g/L；甘油7.0 g/L；CaCl20.067 g/L；pH 7.0；高压灭菌锅中121 ℃条件下灭菌20 min［11］。

Folin-phenol 试剂法测定中性蛋白酶活力：先将待测母液进行离心操作，取离心后的上层清液作为粗酶液，取1mL 粗酶液加入10 mL 离心管，40 ℃水浴加热3 min～5 min 后向试管中加入2%的酪蛋白溶液1mL，水浴条件下反应10 min 后立刻加入2 mL 0.4 mol/L 三氯乙酸溶液以终止反应，15 min 后过滤。吸取0.5 mL 滤液，同时加入福林-酚试剂0.5 mL 和0.4 mol/L 碳酸钠2.5 mL，混匀后于40 ℃反应20 min。采用3 次测定取均值的方法，空白对照组中依次加入2 mL 0.4 mol/L 的三氯乙酸溶液和1mL2%的酪蛋白溶液，15 min 后过滤，后续操作同上。以空白组为对照，在OD680 处测定吸光度。将1mL 酶液每分钟水解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸需要的酶量定义为1 个蛋白酶活单位。以标准100 μg/mL 酪氨酸浓度梯度作标准曲线［12］，见图2。

图2 酪氨酸标准曲线

（4）纤维素酶活性测定。3，5-二硝基水杨酸比色定糖法（DNS）测定样品的纤维素酶活：将菌液离心后移取上清液1 mL 于试管中，加入1 mL CMC-Na 含量0.5%的柠檬酸缓冲液，在水浴锅中50°C 条件下水浴加热30 min 后立刻向试管中滴加DNS 试剂1 mL，将试管置于沸水中煮沸5 min 后，立刻用流水冷却，定容至25 mL，在OD540 处测定吸光度。将测得数值带入标准曲线，算出其含糖量。将1 mL 酶液每分钟水解纤维素产生1 μg 葡萄糖所需的酶量定义为1 个纤维素酶活。用葡萄糖溶液作标准曲线［13］，见图3。

图3 葡萄糖标准曲线

1.2.5 菌种耐盐性测定

准备5 个锥形瓶，在锥形瓶中加入NaCl 浓度分别为0.5%、2.5%、5.0%、7.5%和10.0%的牛肉膏蛋白胨液体培养基（真菌接种到马铃薯培养基中）50 mL，取0.5 mL 24 h 过夜培养的母液（母液培养方法同测定生长曲线时所用方法）分别接种到5 个锥形瓶中，在30 ℃、120 r/min 的震荡培养箱中培养。每次取2 mL 菌液于OD600 处测定菌液的吸光度，每次测量3次取平均，时间间隔为4 h［7］。

1.2.6 菌种测定

将3 种菌株划线到平板上，30 ℃条件下过夜培养，第2 天将长有单菌落的平板送至杭州有康生物技术有限公司进行菌种测定。

2 结果与分析

2.1 生长曲线

根据生长曲线图4 可以得知，3 种菌液的浓度在经过约20 h 培养后均达到最高。因此菌种培养的最适时间取24 h 即可。

图4 3 种菌株的生长曲线

2.2 不同培养基对菌落和水解圈直径的影响

通过菌落直径可以判断菌种在各种大分子有机物中的生长状况，水解圈则表征菌株是否对相应的大分子有机物具有降解能力。但由于各个菌株菌落大小不同，通过水解圈与菌落直径的比值能更直观地表示菌株对于各大分子有机物降解能力的强弱。从图5 中可以看出3 种菌株在油脂和纤维素培养基上都出现水解圈，表明它们可能都是油脂和纤维素的优势降解菌，而其中又以TS-1 的菌圈比最大，说明TS-1 的纤维素降解能力最强；而3 个菌株中只有TS-3 在淀粉培养基中产生水解圈，且菌圈比超过3，说明TS-3 的淀粉降解能力可能较强，其余2 个菌株可能不具备淀粉降解能力。

2.3 菌种产酶

根据酶活测定结果，见图6，TS-2 菌株具有产淀粉酶、脂肪酶、蛋白质酶和纤维素酶活性，表明该菌株对4 种大分子有机物均有一定降解能力，且蛋白质酶活高达345.7 IU，表明其可以作为1 种高效蛋白质降解菌剂的候选菌株。TS-1 测得产蛋白酶225.1 IU 和产纤维素酶30.04 IU；TS-3 不具备产蛋白酶的能力，其产纤维素酶能力也较低，但是淀粉酶活高达437.6 IU 表明该菌株可以作为1 种高效淀粉降解的候选菌株。

图5 菌落生长情况

图6 4 种酶活力

2.4 耐盐性分析

由于饮食差异，各地区厨余垃圾的含盐量有很大不同，而过高的含盐量会影响微生物的生命活动和降解活性，因此研究菌株的耐盐性对微生物降解厨余垃圾具有一定的指导作用，对于高耐盐性的菌株可以免去除盐的预处理步骤。根据3个菌种在不同含盐量的培养液中的生长情况，见图7，其中TS-2 在盐浓度为10%的培养液中呈现出絮状沉淀影响波长测定，因此舍弃，分析如下：TS-1 在浓度7.5%以下的生长条件都较好，且在10%的高浓度下经过72 h 也能够生长，因此可以判断TS-1 的耐盐性良好；TS-2 在盐浓度为7.5%及以下的培养液中生长状况几乎相同，表明在浓度7.5%以下，含盐量对其生长的影响较小。且在10%的高浓度下依然可以生长到正常浓度范围，说明TS-2 的耐盐性强；TS-3 在高低盐浓度下的生长情况差异较大，在含盐量达到5%以上时生长缓慢，即使开始生长，浓度也远远达不到正常水平，耐盐性较差。

2.5 菌种测定

经鉴定，TS-1、TS-2 和TS-3 均属于枯草芽孢杆菌。TS-1的菌落较大，呈现乳白色，形状为规则的圆形，表面光滑平整，容易被挑取；TS-2 的菌落较大，呈现不规则的形状且边缘有不规则的锯齿状，颜色为不透明的白色，表面有细微的隆起，且菌落很干燥，容易被挑取；TS-3 的菌落较小，圆形但周围呈锯齿状，颜色为较透明的白色，菌落由四周向中间隆起，但隆起幅度不大，质地粘稠，难以挑取。

图7 3 种菌株耐盐性情况

图8 3 种菌株的菌落形态

3 小结

本实验从市售腐熟剂中筛选出了3 种菌株，将它们命名为TS-1、TS-2 和TS-3，通过16SrDNA 测得的序列号和菌种库中的序列比对，得出3 种菌都属于枯草芽孢杆菌。同时，通过酶活测定，每个菌都表现出了2 种以上的酶活性，都能够有效降解厨余垃圾。其中TS-2 的脂肪、蛋白质和纤维素的酶活都很高，说明它是1 株厨余垃圾高效降解菌种。

通过耐盐性测试得出TS-1、TS-2 的耐盐性良好，可以适用于大部分的厨余垃圾降解，在实际应用中可以省去除盐的预处理步骤，降低运行成本。