黄芪甲苷在心肌梗死大鼠模型中的心肌保护作用

李梦华

(南阳医学高等专科学校， 南阳 473061)

随着社会经济高速发展及人口老龄化加速，近些年来中国心血管疾病患病率逐年攀升，国家心血管病中心发布的《中国心血管病报告2018》中指出，近3亿心血管病患者人群中多半因心肌梗死引发死亡，致死率排在各病种第一位，成为制约中国公共卫生发展的主要问题之一[1]。心肌梗死(myocardial infarction,MI)的防治主要措施是对缺血心肌恢复再灌注，临床主要采取溶栓药物和手术治疗[2-3]。不足的是，心肌细胞缺血后死亡以每小时20%速度发生，而院外MI患者能在120 min黄金救治时间内进行手术介入的并不多，此外，溶栓药物副作用较大，如凝血机制改变后容易引发体内出血等。若能在心肌出现缺血缺氧时通过药物干预，重建结构和功能完备的侧支循环，修复心肌细胞损伤，维持内环境稳定，实现心肌的“自我搭桥”，成为众多学者研究关注的焦点，在此背景下，治疗性血管新生作为一种新的策略被提出，并在短期内取得了一定的研究进展[4-5]。

依据临床症候的相似性，心肌梗死常归属于中医学“真心痛”“胸痹”等范畴诊治，中医认为“痛则不通，通则不痛”，治疗中尤其注重益气活血、通络止痛。《神农本草经》记载黄芪“可治一切气血虚弱之证”，是中医临床治疗此类疾病的首选中药。团队在前阶段实验中发现黄芪提取物(黄芪总苷)可有效提升离体大鼠内皮祖细胞的生物活性，促进内皮祖细胞发生迁移和黏附，提示黄芪提取物可促进微血管的再生[6]。中药黄芪的主要功能成分黄芪甲苷(astragaloside IV，AS-IV)，化学式为C41H68O14，具有抗炎、抗纤维化、改善脂质代谢、促进伤口愈合等多种功效[7]。现在前期工作基础上，进一步观察AS-IV在MI大鼠模型中对心肌功能和血管生成的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

SD(Sprague Dawley)雄性大鼠24只，10周龄，体重(200±20) g，[北京均可生物工程有限公司，合格证：SCXK(京)2017—0002]。12 h明暗交替循环，置于单独通风的笼子中，自由进食进水，室温(25±1) ℃，湿度(54±6)%，环境噪声小于45 dB。动物实验按照《实验动物护理和使用指南》并经南阳理工学院伦理委员会批准(批准号：NYISTEEC—2017026)。

1.2 建立MI大鼠模型

模型复制采用团队在国家自然科学基金项目中使用的心肌梗死大鼠造模方法[8]。大鼠经戊巴比妥钠麻醉后固定头部和四肢，动物呼吸机维持。心前区备皮消毒后，于胸骨左缘心尖搏动处切开，依次剪开分离，在左前降支处结扎1 min，肉眼可见心室处颜色变浅，心电图显示Ⅱ导联QRS波增宽、ST段弓背抬高，MI大鼠模型复制成功。假手术组开胸后不结扎。为预防术后感染，连续3天灌胃给药氨卞青霉素。

1.3 分组及用药

实验大鼠随机等分假手术对照组(Sham组，等量生理盐水)、AS-IV组[40 mg/(kg·d)]和模型组(MI组，等量生理盐水)各8只，均采用尾静脉注射药物，连续4周。

1.4 超声心动图测量

药物干预4周后，1.5%异氟烷麻醉MI大鼠，小动物超声成像仪(Vevo 3100，VisualSonics，Canda)检测大鼠心脏，采用30 MHz中频扫描头的超声系统评估心脏结构和功能。测量大鼠心脏功能指标：左心室缩短分数(left ventricular fractional shortening,LVFS)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室收缩期内径(left ventricular internal systolic diameter,LVIDs)、左室舒张期内径(left ventricular internal diastolic diameter，LVIDd)。

1.5 免疫组织化学检测

MI大鼠脱臼处死，冰台操作摘取心脏后磷酸盐缓冲液清洗，固定于4%多聚甲醛。酒精分梯度浓度组织脱水后进行包埋，调整厚度5 μm组织切片。依据操作步骤说明，使用Masson染色检测试剂盒(H3208，南京信帆生物技术科技有限公司)进行染色，测量MI大鼠心肌的纤维化程度。为了评估血管密度，进行CD31在心肌梗死边界区域肉芽组织中的免疫染色(GB12063，武汉谷歌生物科技有限公司)。通过光学显微镜(DMIL-RF1，Leica,Germany)放大400倍，使用Image Pro Plus图像软件进行测算分析。

1.6 TUNEL检测

MI大鼠心肌取材、4%多聚甲醛固定、酒精脱水、石蜡包埋切片参照1.5节进行。通过TUNEL试剂盒(货号：FY600017，上海富源生物科技有限公司)依据操作步骤说明，心肌切片采用DAPI溶液染色评估细胞核形态，显微镜下放大400倍对标记的阳性细胞进行成像，在梗死边缘区随机选取5个视野，计算细胞凋亡总数。

1.7 Western blot检测

采用RIPA裂解液溶解MI大鼠心肌组织，4oC下14 000 r/min的速度离心5 min，吸取上清液，依据蛋白检测试剂盒操作步骤检测蛋白含量。将蛋白溶解后依次电泳分离、转移至膜上，加入一抗稀释液(1∶1 000)在35 ℃下孵育1 h，包括:原发性抗体GAPDH(货号：A10025武汉艾美捷生物科技公司)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)(货号：Y1169、Y1175，上海巴士德生物科技有限公司)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(货号：AK015，北京银泰生物科技有限公司)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,AKT)和磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated protein kinase B,p-AKT)(货号：ybP004、ybP001,上海巴士德生物科技有限公司)、半胱天冬氨酶-3(Caspase-3)(货号：AC031武汉艾美捷生物科技公司)洗膜后加入二抗(1∶1 000)稀释液在35 ℃下孵育1 h。使用ECL化学发光试剂使免疫反应条带可视化，通过光密度测定法进行定量。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 AS-IV对MI大鼠心功能的影响

MI大鼠模型经过AS-IV干预4周后，采用超声心动图评价测量各组大鼠心功能指标。模型组与假手术对照组相比，心功能LVFE与LVFS指标测定明显降低，提示心脏射血受阻，而LVIDs与LVIDd指标明显升高(P<0.01)，进一步说明心肌增厚心功能受损。而AS-IV组与模型组相比较，心功能LVFS与LVFE指标明显回升，LVIDs与LVIDd指标有所下降(P<0.05)。表明AS-IV可提升MI大鼠心肌收缩能力和左心室射血功能，对大鼠心功能改善有积极作用。如表1所示。

表1 各组心功能指标Table 1 Cardiac function indexes of each group

2.2 心肌纤维化观察

经过Masson染色后的MI大鼠心肌图片显示，假手术对照组明显看出红色的心肌组织清晰规则，架构整齐，血管腔壁完整；模型组红色心肌排列紊乱，其中坏死心肌由蓝色胶原纤维取代，血管出现破碎；AS-IV组红色心肌较模型组占比高，蓝色胶原纤维相比较少，血管形态较清晰。这些现象表明，AS-IV可降低心肌组织的纤维化程度。如图1所示。

*表示与假手术对照组相比，P<0.01；**表示与模型组相比，P<0.05

2.3 毛细血管密度观察

通过抗CD31免疫组织化学染色计算每个视野的毛细血管密度来确定AS-IV治疗对MI大鼠心肌血管发生水平的作用。假手术对照组和模型组对比，毛细血管密度未观察到显著差异，AS-IV组经治疗后与模型组相比，毛细血管密度显著增加。表明AS-IV可通过增加心肌梗死后毛细血管密度促进血管生成(P<0.05)。如图2所示。

*表示与模型组相比，P<0.05

2.4 心肌细胞凋亡观察

使用TUNEL染色法在手术后4周评估AS-IV对缺血后心肌存活率的作用。观察发现，DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)复染后细胞核显现蓝色，模型组与假手术对照组相比，凋亡心肌细胞的比例明显上升(P<0.05)，与模型组相比，经过AS-IV干预后，凋亡的心肌细胞所占比例有所下降(P<0.05)。Western蛋白印迹表达检测显示，模型组与假手术对照组相比，p-AKT蛋白表达降低显著(P<0.05)，而AS-IV组较MI组p-AKT水平有所提升(P<0.05)；Caspase-3的表达在MI组显著增加，通过AS-IV干预后明显减少。如图3、图4所示。

*表示与假手术对照组相比，P<0.01；**表示与模型组相比，P<0.05

*表示与假手术对照组相比，P<0.01；**表示与模型组相比，P<0.05

2.5 VEGF、VEGFR-2和bFGF的表达

Western蛋白印迹表达检测三组大鼠心肌组织中VEGF、VEGFR-2与bFGF蛋白的定量，模型组与假手术对照组相比，参与血管生成因子VEGF，VEGFR-2与bFGF蛋白表达明显下调(P<0.05)，AS-IV组与模型组相比，VEGF、VEGFR-2和bFGF蛋白水平显著提升(P<0.05)。提示AS-IV可加强血管再生的信号通路传导。如图5所示。

*表示与假手术对照组相比，P<0.01；**表示与模型组相比，P<0.05

3 讨论

心肌缺血缺氧后导致不可逆的心肌组织坏死，产生大量的胶原纤维和增生的结缔组织，严重损害心脏的正常生理功能。本次研究经Masson染色和TUNEL染色证实，心肌梗死模型大鼠的心肌组织受损严重，凋亡细胞增加，胶原纤维增多，血管腔不完整，阻碍了心肌组织的血管新生，这次结果与团队组之前研究结果[9]相一致。治疗性血管新生是促进侧支循环建立的一种新的治疗思路，在改善缺血区域功能，恢复循环灌注具有积极的作用，目前主要方法有基因疗法、细胞疗法、生长因子疗法等，但因存在未知问题较多，经济要求较高，并不具备普适性。中医药治疗心血管疾病历史悠久，效果显著，中医认为心肌梗死主要发病机制是“气虚血瘀”，气行则血脉通畅，气滞则血行无力，易致瘀闭。因此治疗此类疾病，常选具有“补气升阳、拖毒生肌”功效的黄芪作为君药。可见，中医理论的“祛瘀生新”和现代医学的“治疗性血管新生”具有相同的契合之处。

黄芪甲苷是中国《药典》中判断黄芪优劣的常用检测指标。通过采用SD大鼠心脏冠状动脉左前降支结扎的造模方法，心电图检查成功复制MI模型，超声探测显示SD大鼠心功能明显下降，心肌增厚，心肌收缩力降低。经过4周的AS-IV干预，大鼠左心室收缩功能明显好转，这是对中医理论“气主推动，气能行血”的有力说明。完整的细胞形态和毛细血管结构，是恢复灌注的新生血管重要的形态学特征[10]。经过Masson和CD31染色后显示AS-IV组大鼠心肌组织中新生的毛细血管密度明显增多，且血管腔的形态完整，层次清晰，红色心肌细胞所占比例较高，排列规则，从组织形态学显示黄芪甲苷对促进心肌梗死周边的毛细血管新生有着积极的作用。血管生成包括血管的形成和维持，多种信号分子参与血管生成的调节，最重要的就是血管内皮生长因子(VEGF)，它对生理和病理血管生成都是必不可少的。血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)包括VEGFR-1、-2和-3共3个家族成员，其中VEGFR-2位于内皮细胞上，所有的VEGF-A亚型都含有能与VEGFR-2结合并具有相同亲和力的残基，是VEGF-A的主要信号靶受体，参与到人体的生长发育以及各阶段的生理与病理过程。VEGF主要通过血管内皮细胞上VEGFR-2介导激活下游通路发挥生物学作用，加速分化血管内皮细胞，增加了内皮细胞存活率。促进造血干细胞再生等，在细胞分裂和重组的作用中最强[11]。VEGF-A激活受体VEGFR-2信号通路后，唤醒了下游通路因子储存在细胞质中的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)，PI3K通过第二信使改变了静息电位下的AKT结构并全面激活AKT通路，AKT从细胞膜中释放，传递生物信号到细胞质中,参与调控细胞的增殖转录[12]。Caspase-3是AKT的下游分子之一，活化后的Caspase-3可以裂解DNA引起细胞死亡。AKT可以磷酸化Caspase-3的活性，降低生物效应，引起系列的级联反应，控制减少细胞凋亡[13]。bFGF是一种肝素结合生长因子，是胚胎干细胞培养基的首要构成成分，同样作为有效的血管生成因子，参与血管生成和肉芽组织形成的成纤维细胞和内皮细胞的增殖，主要参与介导PI3K/AKT细胞通路发挥作用[14]。经过Western免疫印迹法检测证实，模型组心肌缺血缺氧抑制了VEGF、VEGFR-2、bFGF、AKT蛋白的表达，出现心肌细胞凋亡、毛细血管破裂以及心肌纤维化增多等不良情况，而AS-IV组中VEGF、VEGFR-2和bFGF的表达有所增加，通过促进MI后的心脏血管生成进而保护心脏功能。此外，AS-IV上调了AKT表达，并抑制Caspase-3活性，有效减少了心肌细胞凋亡。提示AS-IV治疗可减轻缺血缺氧对心肌细胞带来的损伤，增强心肌的收缩功能，增加心肌损伤后的血管新生能力，对恢复再灌注循环具有重要作用。

4 结论

综上所述，主要探讨了黄芪甲苷对心脏功能和心肌梗死后组织病理学变化的影响，得到如下实验结果。

(1)黄芪甲苷对MI大鼠的心肌功能有益。

(2)黄芪甲苷可减轻MI后心肌的纤维化程度并减少心肌细胞凋亡。

(3)黄芪甲苷可通过上调VEGF和bFGF的表达促进血管生成。

在本此研究中，初步明确了黄芪甲苷的促血管生成效应，对拓展中药黄芪防治缺血性心脏病提供了实验支持。