内皮糖萼损伤对黄芪多糖调控微血管内皮细胞分泌生物活性物质的影响

张志欢，孙 雄, 2，王兆丽，王 乾，张 涛*

(1.北京农学院 动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206； 2.中牧实业股份有限公司，北京 100070)

内皮糖萼(endothelial glycocalyx)亦称“细胞衣”或“糖衣”，是内皮细胞表面一层富含多糖的绒毛状结构[1, 2]，由蛋白聚糖和糖蛋白构成骨架分子与细胞膜相连，骨架分子上伸出大量的寡糖链。内皮糖萼覆盖于血管内皮细胞表面，具有保护内皮细胞[3]、调节血管壁的屏障和选择性通透[4, 5]、感受血流作用力[6]等作用，尤其对微血管内皮细胞(microvascular endothelial cells，MVECs)，其大部分功能的发挥均有内皮糖萼的参与[7]。鉴于中药多糖与内皮糖萼在化学组成上的相似性，推测外源性中药多糖应能有助于改善内皮糖萼的结构或功能。前期研究[8, 9]表明，黄芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)能显著增加大鼠空肠黏膜MVECs糖萼的厚度，影响糖萼糖链的含量。MVECs的广泛生物学功能主要在于其能够产生多种多样的生物活性物质，中药多糖能够通过调控内皮生物活性物质的产生而影响MVECs的功能，而其对内皮生物活性物质的调控与对糖萼糖链作用的相关性尚不清楚。为了解内皮糖萼糖链在中药多糖调控MVECs分泌生物活性物质中的作用，本试验体外分离培养大鼠空肠黏膜MVECs，以肝素酶III(heparinase III，Hep III)处理，去除部分糖萼糖链，然后使用APS干预，检测一氧化氮(nitric oxide，NO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和白介素6(interleukin 6，IL-6)分泌的变化。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与设备

倒置荧光显微镜(Olympus，IX71型)，酶标仪(Thermofisher，Multiskan Ascent型)，分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司，UV-2000型)，等。

1.2 主要试剂与药品

胎牛血清(Hyclone，货号SH30084.03E)，DMEM培养基(Gibco，货号H2387)，Hep III(SIGMA，货号H8891)，IL-6 ELISA试剂盒(Abcam，货号ab100772)，NO测试盒(南京建成生物工程研究所，货号A012)，SOD测试盒(南京建成生物工程研究所，货号A001)，APS(纯度67%)由北京生泰尔生物科技有限公司惠赠，等。

1.3 MVECs分离培养

本试验所用MVECs分离培养自7日龄SD大鼠空肠黏膜组织，参照相关文献[9, 10]中的方法进行。即无菌取大鼠空肠组织，剪成约5 cm小段，纵向剖开、漂洗，刮取肠黏膜组织于0.1%胶原酶Ⅱ型溶液，剪碎，消化约60 min至无明显组织块，过孔径100 μm细胞筛，滤液1 000 r/min离心5 min，沉淀用含20%胎牛血清的DMEM完全培养基重悬、接种，置于含5% CO2、37 ℃恒温恒湿培养箱静置孵育，2 h后洗去未贴壁细胞，更换完全培养基后继续静置培养至汇合状态。胰蛋白酶消化脱壁，传代培养，采用血小板内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule，PECAM-1)免疫荧光染色法进行鉴定。

1.4 细胞分组与处理

将大鼠空肠黏膜MVECs传代于96孔板，分为对照组、APS组、Hep III组和Hep III + APS组，每组5孔。待细胞生长至亚汇合状态后，各组更换为含2%胎牛血清的维持培养基。其中，对照组维持培养基不作处理，APS组维持培养基另含50 μg/mL APS；Hep III组在更换维持培养基前2 h，先加入终浓度为20 mU/mL Hep III预处理；Hep III + APS组在更换维持培养基前2 h先加入终浓度为20 mU/mL Hep III预处理，维持培养基中另含50 μg/mL APS。各组细胞在更换维持培养基24 h后，采取培养基上清，离心后检测NO、IL-6的含量和SOD的活力。

1.5 细胞因子的检测

细胞培养基上清中NO含量和SOD活力采用生化试剂盒检测，IL-6的含量采用ELISA试剂盒检测，操作步骤参照试剂盒说明书中进行，计算NO、IL-6的浓度和SOD的活力。

各组数据以“平均值±标准差”表示，在F检验(双样本方差检验)的基础上，对各指标采用Excel软件中“等方差t-检验”进行组间的统计学差异比较。

2 结 果

2.1 大鼠空肠黏膜MVECs的形态与鉴定

分离培养的大鼠空肠黏膜MVECs呈纺锤形或多边形，大多数细胞有2个长凸起，生长至汇合状态后呈单层，出现明显的生长抑制，经PECAM-1免疫荧光染色鉴定显示(图1)，95%以上细胞呈阳性着色。细胞的传代培养特性良好，连续传至20余代时未见明显形态变化。

2.2 NO分泌量的变化

对各组细胞培养基上清中NO含量的检测结果显示(图2)，大鼠空肠黏膜MVECs正常情况下分泌一定量的NO；培养基中添加APS孵育后NO的含量略有增加(P>0.05)；Hep III组消化除去部分糖链后，培养基中NO含量与对照组比较显著降低(P<0.05)；APS与Hep III共同处理时，MVECs的NO分泌量高于Hep III单独处理时，而显著性低于APS组(P<0.05)，与对照组比较，二者统计学上无显著性差异(P>0.05)。

2.3 SOD活力的变化

APS和Hep III处理对大鼠空肠黏膜MVECs产生SOD的影响与NO类似。结果显示(图3)，对照组细胞培养基中有一定的SOD活力；培养基中加入APS孵育后，其SOD的活力比对照组有一定程度的升高(P>0.05)；Hep III处理部分去除内皮糖萼糖链后，SOD的活力显著性下降(P<0.05)；而APS和Hep III共同孵育处理MVECs时，SOD活力显著性低于APS组(P<0.05)，而与对照组比较，统计学分析表明二者无显著性差异(P>0.05)。

2.4 IL-6分泌量的变化

检测结果显示(图4)，大鼠空肠黏膜MVECs正常情况下分泌一定量的IL-6；细胞培养基中加入APS处理后，IL-6的分泌量显著下降(P<0.05)，而Hep III处理后其分泌量显著上升(P<0.05)；采用APS和Hep III共同孵育处理时，IL-6的分泌量较Hep III组下降，而极显著性高于APS组(P<0.01)，与正常对照组比较无显著性差异(P>0.05)。

3 讨 论

尽管早在1966年内皮糖萼已通过电子显微镜被首次观察到[11]，但直至过去十数年中才对其组成和功能逐渐了解。在以蛋白聚糖和糖蛋白等为主构成的网络基体中，大量的内皮源性或血源性可溶性分子嵌入其中。内皮糖萼的破坏或脱落不仅影响白细胞与MVECs的黏附，也会使细胞因子等可溶性分子的合成和降解失去动态平衡，其完整性对MVECs功能的正常发挥具有重要意义。APS因其在抗氧化、抗炎和免疫调节等方面的生物学作用而被熟知和广泛应用[12, 13]，在前期研究表明APS显著改善内皮糖萼厚度和糖链含量的基础上，本试验进一步深入探索了APS调控内皮糖萼与内皮细胞因子分泌的相关性。结果表明，Hep III部分去除内皮糖萼，能显著降低APS对大鼠空肠黏膜MVECs分泌NO、SOD和IL-6的作用。

内皮糖萼糖链不仅能够保护MVECs免受致病因子损伤，维持其细胞因子合成功能，而且糖链形成的细胞表面网筛状结构，也为大量细胞因子的停泊提供了可能，这些生物活性分子影响着其所在局部的环境，维持着局部微环境的稳定。本试验基于APS的常见生物学作用，选择了机体细胞功能的重要信使和效应分子NO，通过清除氧自由基对机体氧化与抗氧化平衡起着至关重要作用SOD，及对炎症反应和免疫应答具有多效性作用的IL-6，作为评价内皮糖萼在APS调控细胞因子分泌中作用的指标。Hep III能够特异性切割硫酸乙酰肝素类分子中GlcNS/GlcNAc(1→4)GlcA之间的链接键，常用来部分降解去除内皮糖萼的糖链[14]，本试验亦选择Hep III作为内皮糖萼糖链的降解酶。

当前细胞因子对内皮糖萼糖链影响的文献报道较多，而有关内皮糖萼在细胞因子分泌中作用的研究文献较少。Nikmanes等[15]研究认为，采用肝素酶破坏内皮糖萼后，内皮性一氧化氮合酶的合成受阻；本试验使用Hep III处理后，大鼠空肠黏膜MVECs分泌NO下降，其机制是否与一氧化氮合酶的合成受阻有关尚需进一步研究。而Dekker等[16]以透明质酸酶处理内皮糖萼后发现，能够刺激流体依赖性内皮源NO的释放，这与本试验使用Hep III的静态处理结果不同，这表明内皮糖萼的降解对内皮源性NO产生的影响是多方面的，其生物学效应需要综合分析。Ramnath等[17]研究发现，促炎细胞因子IL-6在炎症引起游离糖萼组分升高时会进一步释放；Huang等[18]研究也显示，小檗碱通过减缓LPS诱导的内皮糖萼降解，能够抑制IL-6的产生及活性氧自由基的增加，这表明破坏内皮糖萼是IL-6产生及活性氧自由基增加的原因之一。本试验研究结果表明，Hep III处理诱导IL-6分泌增加和SOD活性下降，SOD活性的下降可能是造成活性氧自由基的重要原因，另一方面，Hep III降解部分内皮糖萼糖链，显著抑制了APS对NO、SOD和IL-6的影响，这也表明内皮糖萼在APS调控大鼠空肠黏膜MVECs分泌生物活性物质中具有重要作用。

综上所述，本试验研究结果表明，内皮糖萼糖链在APS诱导大鼠空肠黏膜MVECs分泌细胞因子NO、SOD和IL-6中具有重要作用，其降解能够显著抑制APS对NO和SOD分泌的上调作用及对IL-6分泌的下调作用。