叶用莴苣LsARF1的生物信息学分析及其表达

武 扬，姜尚昆，韩春晖，王婷甄，范双喜，郝敬虹

(农业应用新技术北京市重点实验室/北京农学院 植物科学技术学院，北京102206)

叶用莴苣成为各地生熟兼用、市场热销的重要叶类蔬菜。叶用莴苣喜冷凉湿润的气候条件，在15～20 ℃时生长最佳，超过30 ℃时则易生长不良，发生抽薹，影响食用品质，严重时导致减产绝收。这一问题在生菜的周年生产中亟需解决。[1，2]。

植物生长素是活性植物细胞自身分泌的一类激素，主要调控植物的生长方向，细胞的生长和分裂、组织的分化、植物器官的形成、茎的向性运动、叶的衰老脱落等，在某些植物种类中，生长素还参与诱导开花等[3]。而生长素参与调控的大多数发育过程则都是通过基因的表达来调控的[4]。在课题组前期的研究推论生长素在叶用莴苣的抽薹过程中起着重要的作用。

大多数植物中，生长素响应基因受TIR1，生长素响应因子(ARF)家族，以及AUX/IAA转录因子家族的调控[5]。近年来，研究表明植物生长素信号转导可能是通过调控ARFs来实现的[6]。典型的ARF在其氨基末端具有B3 DNA结合结构域(DBD)，中间区(MR)以及羧基末端的二聚化作用结构域(CTD)[7]。CTD结构域具有III和IV结构域，与Aux/IAA蛋白类似，能够在ARFs和Aux/IAAs之间形成同型二聚体和异型二聚体[8]。ARF家族成员众多，不同ARF蛋白之间在功能上存在明显差异。Sessions等发现AtARF3在拟南芥花器官的形成中起重要作用[9]。另一项研究则表明AtARF5参与胚胎模式的形成和维管组织的发育[10]。遗传试验表明，AtARF8是拟南芥果实发育的负调控因子，抑制其表达可诱导拟南芥单性结实[11]。SlARF4参与了番茄果实发育过程中糖代谢的调控[12]，SlARF7调控番茄果实结实和发育过程中植物生长素信号的转导并介导植物生长素和赤霉素信号转导[13]。在水稻胚胎组织中，OsARF1表达量显著高于其在营养组织中的表达量，沉默OsARF1会使植株出现长势变弱，叶片变小卷曲，不育等显现[14]。拟南芥中，AtARF1和AtARF2均控制拟南芥叶片衰老和花器官脱落，且AtARF1是一个转录抑制因子[15]。

课题组在之前对高温抽薹组和对照组的差异蛋白分析中，生长素响应因子ARF1蛋白存在显著差异，推测其与抽薹有关。但ARF1基因在生菜中的作用机理及其与生菜抽薹的关系仍不清楚。因此进行了LsARF1基因的生物信息学分析，并采用实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,qRT-PCR)技术分析不同温度和时间点下的表达情况，为进一步研究其在叶用莴苣抽薹中的相关作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以叶用莴苣(LactucasativaL.)易抽薹半结球型品种GB-30为试材(在农业应用新技术北京市重点实验室进行了编号和保存)实验于2019年9月在北京农学院日光温室中进行。选取颗粒饱满、大小均一的种子，常规方法催芽。将发芽情况较为整齐的种子播种于装有基质的穴盘中，于北京农学院日光温室中培养(光照条件为光照14 h，黑暗10 h；温度为白天(20±2) ℃，夜间(13±2) ℃，相对湿度为65%～75%)。待幼苗生长至3叶1心时移栽至10cm口径营养钵中。待幼苗长到6叶1心时，选取生长一致的植株移入人工气候箱。在温度为(20±2) ℃/(13±2) ℃(昼/夜)、光周期14 h/10 h(昼/夜)、相对湿度60%、光照强度300 μmol/(m2·s)的条件下适应2 d。之后，将幼苗分成2组：第1组幼苗一直生长在上述环境中，作为对照；第2组幼苗进行(33±2) ℃/(25±2) ℃高温胁迫处理。在处理的0、8、16、24 d时取样(前期研究结果表明高温处理8 d开始抽薹)，取样部位为花茎，每5株作为1次重复，每个样品取样进行3次重复。在液氮中速冻后，于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 试验方法

1.2.1 叶用莴苣总RNA提取与反转录 采用艾德莱总RNA提取试剂盒，提取叶用莴苣的总RNA。cDNA第一链的合成按照全式金反转录试剂盒提供的方法进行。

1.2.2 生物信息学分析 对蛋白质参数进行在线分析：ProtParam(http://web.expasy.org/protparam)。进行信号肽分析：SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/signal p/)。NPS@(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpagenpsa_sopma.html)的自优化比对预测方法(SOPMA)预测氨基酸的二级结构。NCBI CD-search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi公司)用于分析蛋白质的保守结构。NCBI ProteinBLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)用于在线搜索LsARF1氨基酸序列的同源序列。MEME软件用于分析保守基序。ProtComp(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)和PSORT(https://psort.hgc.jp/)用于预测蛋白质的亚细胞定位。SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)用于预测蛋白质的三级结构。MEGA7中的邻域连接方法用于构建系统发育树。

1.2.3 叶用莴苣ARF1基因表达分析 利用已知的拟南芥ARF1基因序列，在NCBI中的叶用莴苣全基因组库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_002870075.1)中进行比对，根据基因序列设计特异性qPCR引物ARF1-F：CGCGTTGGAGTAAGGAGGCTTATG和ARF1-R：TGCATGAGAGGCAGTAGCAAGAAC。以叶用莴苣18S rRNA基因(HM047292.1)作为内参基因。使用20 μL体系与Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪上检测LsARF1基因的表达量。扩增程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，循环数39，进行3次独立重复试验。

荧光定量PCR所得数据采用2-ΔΔCt法进行计算。采用统计分析软件SPSS12.5(International Business Machine，Chicago，IL)对数据进行统计分析，Origin9(Origin Lab，Northampton，MA,USA)绘制图表。

2 结果与分析

2.1 叶用莴苣LsARF1基因序列分析

LsARF1基因编码区的核苷酸序列长1 968 bp，共编码656个氨基酸，LsARF1基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列如图1所示。

利用ProtParam软件分析LsARF1基因编码的氨基酸序列，得出LsARF1蛋白的分子量为74 kDa，理论等电点为5.79。它的Ser，Leu和Glu水平较高，分别为10.2%，8.4%和8.2%，Cys，Trp和Tyr水平较低，分别为1.8%，1.8%和2.0%，总计84个带负电荷的残基(Asp+Glu)，总共66个带正电荷的残基(Arg+Lys)，不稳定性指数为55.4(不稳定的蛋白质)，平均亲水性值为-0.53，预测为亲水性蛋白质。SignalP4.0分析表明，该蛋白质不含信号肽或跨膜结构域，也不是分泌蛋白。

通过NPS@的SOPMA预测LsARF1蛋白的二级结构，发现该蛋白中α-螺旋占19.85%，387个氨基酸残基组成无规则卷曲，含量高达59.08%，延伸链占16.18%，最少的是β-折叠，仅占4.89%。

2.2 叶用莴苣LsARF1保守结构域与多重序列比对分析

利用NCBI CD-esarch分析该蛋白的保守结构，发现该蛋白具有3个结构域，即B3，Auxin_resp，AUX_IAA结构域(图2)。 B3结构域是ARF蛋白与DNA结合的区域；而Auxin_resp是ARF家族的保守结构域； AUX_IAA是ARF蛋白的二聚化结合位点。大多数ARF蛋白具有这三个结构域。根据氨基酸序列分析的结果，可以得出结论，LsARF1蛋白可能具有与ARF蛋白家族的功能。

利用DNAMAN7.0对叶用莴苣、向日葵和黄花蒿的ARF1氨基酸序列进行比对，发现LsARF1蛋白与其他物种具有高度相似性。 N-末端保守性较高，C-保守性较差，并且有更多的可变序列。(图3)

2.3 LsARF8蛋白的生物信息学分析

进一步使用SWISS-MODEL软件对LsARF1进行同源建模，推测ARF1蛋白的三级结构，发现它包含ARF家族特有的保守结构(图4)。此结果与NCBI CD-search分析一致。

2.4 叶用莴苣LsARF1蛋白的系统进化分析

将获得的LsARF1氨基酸序列与NCBI蛋白数据库中的ARF1序列进行比对，发现它与向日葵、大豆和芝麻等10种植物的ARF1蛋白具有较高同源性。利用MEGA 7.0软件工具构建高度同源蛋白序列的系统发育树。这11个氨基酸序列清楚地分为二类，第一类是猕猴桃和芝麻，莴苣和刺苞菜蓟为第二类。莴苣和刺苞菜蓟均为菊科的农作物，同源程度较高(图5)。

2.5 叶用莴苣LsARF1基因在高温抽薹中的表达分析

通过qRT-PCR，检测了叶用莴苣易抽薹品种GB-30茎部试材在高温-常温处理下LsARF1基因的相对表达量(图6)。结果显示，在处理后的8 d，高温组和对照组中基因的相对表达量开始出现分歧，其间，对照组基因的相对表达量均高于高温组的；高温组基因的相对表达量呈现先下降后上升的趋势，对照组基因的相对表达量则一直呈现上升趋势。

综上分析，高温使叶用莴苣茎中LsARF1基因的相对表达量发生显著变化。

3 讨 论

近年来，随着多个物种全基因组研究的发展，先后在拟南芥、番茄、黄瓜等植物中鉴定出ARF基因家族成员。这些进展为研究ARFs在植物生长发育过程中的作用机制以及这些因子参与信号的转导、逆境胁迫应答等提供了坚实的基础。Ellis等表明拟南芥ARF1在花的发育时高表达,而在其他部位含量较低,甚至不表达，表达量受外源光调节，arf1arf2突变体花药开裂延迟[16]。Hirotaka等研究发现，MpARF1是生长素敏感转录因子，生长素能解除Aux/IAA介导的MpARF1转录活性，MpARF1突变导致地钱发生明显的发育缺陷表型[17]。水稻中的OsARF1基因也受生长素调节，与胚芽鞘的向性有关[18]。RIN13在褐飞虱叶片中的瞬时表达可加速叶片衰老和细胞死亡，并影响ROS清除酶的活性，ARF1与RIN13相互作用，通过改变ARF1亚细胞定位来加速叶片衰老和细胞死亡[19]。ARF1对果实发育具有调控作用，如PpARF1在桃硬核期果实中有重要的调控作用[20]，VvARF1参与葡萄浆果发育[21]。在杨树中，PdPapARF1调节促进生长和防御反应，也是不定根形成的积极刺激因子[22]。茶树越冬芽深休眠和萌动期，CsARF1表达量较高,表明该基因与越冬芽的休眠及解除休眠密切相关[23]。

在本研究中，使用多种分析软件对LsARF1蛋白进行生物信息学分析。通过分析，发现LsARF1蛋白具有典型的ARF蛋白家族的保守结构，并预测其在细胞核中的亚细胞定位，为研究LsARF1蛋白的功能奠定了基础。通过对LsARF1基因在不同温度下在易抽薹品种GB-30中基因表达水平的分析，高温组与对照组在处理第8天开始出现差异，在处理第16天差异变得显著，LsARF1基因表达水平由于高温的抑制而显著降低，高温组叶用莴苣茎部开始出现快速生长。已有的研究可以推测，叶用莴苣发生抽薹与生长素响应因子LsARF1基因的表达被抑制有关。相信随着研究的不断深入，LsARF1与叶用莴苣抽薹之间的关系以及更多的抽薹相关机制将会被揭示。