克罗恩病患者骨质疏松症的影响因素分析

郑鑫辉，崔慧丽，邵 进，孔德策，赵一丁，杨铁毅

(1.宁夏医科大学研究生院，宁夏 银川 750004；2.郑州大学第一附属医院神经内科，河南 郑州 450000；3.上海市浦东新区公利医院骨科，上海 200135)

克罗恩病（Crohn's disease，CD）是一种慢性炎症性肠道疾病，以免疫介导和临床反复发作过程为特征，CD 和溃疡性结肠炎统称为炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）[1，2]。CD 病因的确切机制尚不清楚，但有研究认为可能是肠道通透性受损以及自身免疫、环境因素等共同导致的结果[3，4]。粪钙卫蛋白（fecal calprotectin，FC）可以作为CD 患者肠道严重程度的量化指标[5]；zonulin 是调节细胞间紧密连接的调节剂，参与肠道通透性的调节[6]；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是参与CD 病理生理学相关的促炎细胞因子[7]，这些指标对CD 的诊断和治疗进展都有深远的影响。CD 患者有降低BMD 和骨质疏松的风险，据报道[8，9]，CD 和骨质疏松症存在显著相关性，且CD 患者发生骨折的风险增加。CD 导致骨密度（bone mineral density，BMD）降低可能机制包括吸收不良和营养不良、限制饮食（低维生素D 和钙的摄入）、类固醇的使用、低身体质量指数（body mass index，BMI）等[10，11]。然而肠道炎症过程本身的作用及肠道通透性的作用尚未广泛研究。骨质疏松症作为炎性肠病的主要并发症如何受肠道炎症影响的发病机制尚不明确。基于此，本研究通过对肠道炎症指标FC、血清zonulin、血清TNF-α 水平及对肠道组织进行免疫组化和免疫荧光的观察，探究CD 患者骨质疏松症可能的影响因素，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019 年1 月～2020 年10 月上海市浦东新区公利医院诊断的60 例CD 患者设为CD组，纳入标准：①符合CD 诊断标准；②年龄≥50岁。排除标准：①伴有内分泌系统疾病以及自身免疫系统疾病、遗传性相关疾病患者；②肝肾功能异常患者；③就诊前服用过影响骨代谢药物史患者；④传染病史。另选取同期门诊就诊的20 例体检健康人员作为健康对照组。CD 组男28 例，女32 例，年龄51～79 岁，平均年龄61.55 岁；健康对照组男10 例，女10 例，年龄50～73 岁，平均年龄60.09 岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究已经通过上海市浦东新区公利医院临床医学研究伦理委员会审批并取得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 BMD 检测 采用美国GE 公司生产的Prodigy型双能X 线吸收骨密度仪，BMD 值以g/cm2为单位，测定部位为L1～L4腰椎。参照2014 年WHO 制定的骨质疏松症T 值界定标准：T 值≥-1.0 为骨量正常，T 值-2.5～-1.0 为骨量减少,T 值≤-2.5 判定为骨质疏松。

1.2.2 粪钙卫蛋白测定 患者于门诊就诊时直接留取其粪便标本，按照9 ml/g 加0.01 mol/L PBS 进行配比，最终得到粪便质量：PBS 体积为1∶9。在冰上震荡15 min 后于5000 xg 离心10 min，取上清液进行检测。根据粪钙卫蛋白试剂盒（华美生物，武汉）说明书中实验步骤，测定其含量。

1.2.3 血清zonulin、炎性因子测定 早晨空腹抽取受试者外周肘静脉血，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定zonulin、TNF-α 水平。根据zonulin 蛋白试剂盒（华美生物，武汉）、TNF-α 试剂盒（上海恒远生物，上海）说明书中实验步骤，在涂有特定单克隆抗体的96 孔板中添加标准液和测试血清，室温孵育1 h 后，将板子在缓冲液中漂洗后加入相应二抗，室温孵育45 min，再次漂洗后加入配置好的显色液，使用酶标仪（Thermo Fisher Scientific Inc.，USA）测量各孔的吸光度，对照标准曲线，计算相应含量[12]。

1.2.4 组织取材及ZO-1 表达检测 在持续心电监护状态下分别使用电子肠镜及活检钳留取受试者结肠组织标本，大小为2 mm×3 mm。组织标本置于40 g/L多聚甲醛溶液（pH 7.4）中，放置4 ℃固定24 h，常规脱水、透明、浸润，利用石蜡包埋后，使用组织切片机进行切片处理，每个切片片厚4 μm。放到干燥箱内烘烤，设置温度为80 ℃。脱蜡、脱水，利用H2O2去离子水消除内源性过氧化物酶活性，然后利用枸橼酸钠缓冲液在高温高压下抗原修8 min，再用PBS 洗涤。滴加正常山羊血清封闭液，随后滴加稀释的一抗工作液（抗ZO-1 抗体，购自Abcam 公司，1∶800 稀释），4 ℃环境下放置一夜。在常规温度下进行复温处理，PBS 洗涤5 次。滴加辣根过氧化物酶标记的二抗（羊抗鼠IgG，购自博奥森公司，1∶800 稀释），孵育40 min，PBS 洗涤3 遍。一方面免疫组化DAB 显色、苏木精复染、脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，OlympusIX51 显微镜下观察肠粘膜组化免疫显色情况；另一方面免疫荧光滴加二抗（绿）（羊抗鼠IgG，购自博奥森公司，1∶1000 稀释），室温孵育3 h，PBS洗3 遍，Hochest 染色液5 min，PBS 洗3 遍，甘油封片，Olympus IX51 显微镜下观察ZO-1 的表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析。计量资料呈正态分布且方差齐性采用t检验，呈正态分布但方差不齐采用校正t检验，均以（）表示；不符合正态分布，则采用Wilcoxon 秩和检验，以[M（P25，P75）]表示。计数资料采用χ2检验，以[n（%）]表示。线性相关分析采用Spearman 秩相关，相关系数以r表示。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组BMD、FC、血清zonulin、TNF-α 比较 CD 组BMD 低于对照组，FC、血清zonulin、TNF-α 高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 CD 患者BMD 与血清zonulin、FC、TNF-α 相关性分析 Spearman 相关分析显示，BMD 与FC、血清zonulin、TNF-α 均呈负相关（P＜0.05），见表2。

表1 两组BMD、FC、血清zonulin、TNF-α 比较[，M（P25，P75）]

表1 两组BMD、FC、血清zonulin、TNF-α 比较[，M（P25，P75）]

表2 CD 患者BMD 与血清zonulin、FC、TNF-α 相关性分析

2.3 健康对照组和CD 组结肠组织中ZO-1 表达及荧光强度情况比较 免疫组化染色显示，与健康对照组相比较，CD 组结肠内ZO-1 表达减少、荧光强度减弱，差异有统计学意义（P＜0.05）；免疫荧光染色显示，与健康对照组比较，CD 组中黄色颗粒状物质明显减少；且健康对照组中有丰富表达典型的网状蛋白（ZO-1 的网状染色），CD 组网状蛋白形态被破坏并且不规则地分布，见图1。

图1 健康对照组和CD 组结肠组织中ZO-1 表达及荧光强度情况

3 讨论

骨质疏松是一种以骨量下降和骨细微结构破坏为特征的系统性骨病，尤其在中高龄群体常发，是骨折风险的高危因素，已成为CD 患者发病率较高的肠外表现。研究表明[12-14]，CD 患者中骨质疏松症的诊断率高达19.8%，其主要的危险因素包括肠道炎症的活动性和严重程度、肠道吸收不良导致的钙、锌的摄入不足等。因此，减少CD 患者的肠道炎症程度可能成为治疗骨质疏松的必要环节。FC 作为肠道炎症的敏感标志物，是由炎症反应中被活化的肠道中性粒细胞分泌，能抵抗酶的降解，一方面其表达水平不仅能够预测治疗效果，还能够反映肠道粘膜病变的严重程度[15]；另一方面，FC 含量与CD 的组织学缓解和粘膜是否愈合具有良好的相关性，而且FC 与CD 的组织学检查结果（内窥镜评分）有也很好的相关性[16，17]，因此其可作为监测CD 炎症活动状态的辅助措施。

本研究结果发现，CD 组FC 水平较健康组升高，且与BMD 存在负相关（P＜0.05），提示肠道炎症的严重程度可能影响BMD 的水平，进一步验证了FC 作为CD 诊断的辅助性检查指标的可靠性[18]。同时，有研究显示[10]，CD 患者骨质疏松发生率有明显上升趋势，表明肠道炎症与BMD 下降具有相关性，当肠道炎症的活动性增高时，很可能会导致BMD的下降。但肠道炎症本身会导致多种有害因素，而这些有害因素与BMD 降低具有一定的相关性，研究表明[19]，CD 患者的BMD 会随着病情的缓解而有所改善。因此，采用非侵入性且简单有效的检查手段量化CD 患者的肠道炎症的改变，进而通过治疗肠道炎症来减缓骨质疏松的进程，这种方式可能成为未来治疗CD 诱导骨质疏松的主要方向。

血清zonulin 升高会通过破坏肠道上皮细胞的紧密连接来影响肠通透性，使紧密蛋白ZO-1 的结构破坏，其浓度的增加与肠道屏障完整性的丧失有关，肠通透性的增加在CD 的发病机制中发挥了核心的作用[20，21]。粘膜屏障的改变会导致肠道通透性增加，从而促进肠腔内物质的暴露，并触发肠道炎症的免疫反应，进而导致CD 的发生[22]。既往研究表明[23，24]，在CD 患者中血清zonulin 水平明显升高。本研究中CD 组血清zonulin 水平高于健康对照组，且与BMD存在负相关（P＜0.05），提示CD 患者的肠通透性受损，使血清zonulin 的表达上调并且肠道屏障的破坏与BMD 下降具有相关性。尽管目前关于血清zonulin 与BMD 关系的研究较少，但有研究表明[25]，肠道屏障功能参与糖皮质激素诱导的骨质疏松症（GIO），并确定了肠道是预防GIO 的新型治疗靶标。因此，肠道通透性的增加可能是CD 诱导骨质疏松的重要条件，通过定量检测血清zonulin 的水平来观察肠道通透性的改变，一方面zonulin 水平可能成为CD 的辅助诊断，另一方面其还可以作为CD 诱导骨质疏松的进展评估。ZO-1 是肠道屏障的组成部分，当肠道屏障遭到破坏时，ZO-1 表达及其结构就会遭到破坏[26，27]。本研究中通过肠道活检发现，CD 患者的肠道免疫组化和免疫荧光结果显示紧密连接蛋白遭到破坏，进一步验证了CD 患者的肠通透性受损。这些观察结果与以下假设相符：增加肠道通透性可能是CD 诱导骨质疏松的重要条件。因此，有必要进行进一步的研究，以评估CD 患者若恢复肠屏障功能能否对骨质疏松的进展起到抑制作用。

CD 患者体内存在着免疫介导的炎症状态，其特征是不同炎症通路的激活和TNF-α 等不同细胞因子的异常分泌，抗TNF-α 是治疗CD 的首选生物疗法[7]。TNF-α 是破骨细胞形成的主要角色，可通过诱导NF-κB 转录的激活，并通过抑制成骨细胞分化减少骨形成，进而导致BMD 改变[28]。因此，TNF-α不仅在CD 的发病机制中发挥核心作用，还参与骨代谢，通过调节破骨细胞活性促进骨吸收。本研究结果显示，CD 组TNF-α 水平高于健康对照组，且与BMD 存在负相关（P＜0.05），提示肠道炎症诱导的骨质疏松可能与自身免疫调节异常有关。持续的炎症或肠道屏障完整性的长期失调会引发或加剧CD，而且炎症性细胞因子TNF-α 增加通过改变紧密连接功能和结构使上皮通透性增加[29]。因此猜测，肠道炎症改变、肠道通透性增加和炎症相关通路三者之间相互影响，共同促进BMD 下降。但由于本研究的样本少，设计局限，观察周期短等不足之处，上述猜测需进一步深入研究证实。

综上所述，FC、血清zonulin 的水平检测对CD患者肠道炎症改变和肠道通透性评估具有一定价值，CD 诱导的BMD 改变与肠道炎症改变、肠道通透性增加及血清TNF-α 具有相关性。但针对炎症反应的治疗仍需进一步探索，以缓解或恢复CD 患者的肠道功能，从而控制骨质疏松。