黄芩水提取物对植物软腐病菌的抑制作用研究

于紫垣 孙悦 李分 杨芬 张潇洁

摘    要：通過打孔法和倍比稀释法研究黄芩水提取物对植物软腐病菌的体外抑菌效果，利用分析检测系统细胞主要内容物的渗漏问题来检测采用黄芩水提取液对供试菌细胞膜和细胞壁的破坏能力。研究可知：黄芩水提取物能有效抑制植物软腐病菌的活性，破坏植物软腐病菌的细胞壁和细胞膜，为黄芩的临床应用提供理论基础。

关键词：黄芩;提取物;植物软腐病菌;抑制作用

文章编号： 1005-2690（2021）04-0009-02       中国图书分类号： R284.1       文献标志码： B

中药黄芩指多年草本植物黄芩的干燥根，属唇形科。黄芩疗效确切，具有清热燥湿、泻火解毒、安胎、止血等作用，为中医常用药物之一[1]。黄芩可分离出黄苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类主要成分，烯丙醇、石竹烯等挥发油类物质成分，多糖类活性成分，此外还含有铁、铜、锌、锰等微量金属元素。随着研究深入，发现黄芩的成分可以在许多疾病中发挥治疗作用，如抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、心血管保护、抗高血糖和预防并发症等。

虽然使用抗生素可以有效控制并根治许多由细菌、真菌等引起的感染性疾病，但由于抗生素滥用，导致出现耐药菌株种类数增长及细菌加速变异，降低了抗生素的功效，这已成为当前主要临床药物治疗中最棘手的难题之一。

研究黄芩水提取物对植物软腐真菌的体外抑菌作用[2]，为解决耐药问题提供了理论依据，也为今后研究应用提供了参考。

1   材料

（1）菌株：植物软腐病菌的菌种由西北民族大学中马实验室菌种储藏室提供。

（2）药物与试剂：黄芩购自甘肃省兰州紫光药业有限责任公司;麦氏比浊管（广州成仪仪器有限公司）;实验室内制备液体LB肉汤、LB琼脂平板等。

（3）仪器：仪器名称与购入厂家如表1所示。

2   试验内容

2.1   黄芩水提取物的制备

取黄芩粗粉80 g，按料液比1∶10加入一些纯净水浸泡24 h，加热回流提取3次，每次2 h过滤后取上清液抽滤回收，下层滤渣继续加入适量的纯净水加热回流，将3次所取得的滤液放入旋转蒸发仪内浓缩，体积至黄芩粗粉的重量80 g，将药液直接放入冻干机烘干得到干燥固体后待用，研碎为粉末，即取得冻干粉。

2.2   抑菌圈的测定

取冻干粉加入纯净水稀释，将其配制成0.125 g/mL的药液。用灭菌过的接菌环挑单菌落置液体LB中放入33 ℃、180 r/min摇床中摇12 h，将菌液在摇床中取出，取2 mL加入新的液体LB中，放入摇床摇2 h，将摇好的菌液离心，倒掉上清液，加入PBS缓冲溶液摇匀，重复离心两次，将最终的菌液加入适量的PBS缓冲溶液直至与M=0.5麦氏比浊管比浊相当（测吸光度为0.1，PBS缓冲液为对照）。取100 μL菌液均匀的涂满琼脂平板，后采用打孔法打孔器打孔，将孔内物用杀菌过的针头挑出，将80 μL的药液加入孔中，置33 ℃恒温恒湿培养箱中培养24 h，测量抑菌圈直径[3]。2.3   最小抑菌浓度（MIC）的测定

测定方法为微量稀释法[4-5]。取经高压灭菌过的试管，将已配制好的药液按照一定倍数进行稀释，1～10号试管内药物浓度依次为0.125 g/mL、0.062 5 g/mL、0.031 25 g/mL、0.016 g/mL、0.008 g/mL、0.004 g/mL、0.002 g/mL、0.001 g/mL、0.000 5 g/mL、0.000 25 g/mL、0.000 125 g/mL。将上步制备的菌液用PBS缓冲溶液稀释100倍后，取2 mL菌液分别加入1～10号试管中，阴性对照为第11号试管（只加2.0 mL液体LB和药液，不加菌液）;阳性对照为第12号试管（加入液体LB 2.0 mL、菌液2.0 mL）。后将1～12号试验管和对照管置于33 ℃摇床中24 h后取出，观察澄清度，无菌生长最小抑菌浓度（MIC），重复3组试验。

2.4   最小杀菌浓度（MBC）的测定

分别取上述MIC测定中无菌生长的3支试管液体，在无菌环境下用高温灭菌后冷却的接种棒将试管中各液体均匀涂在固体培养基上，放入33 ℃培养箱中恒温培养12 h，观察结果，无菌生长即为MBC。

2.5   DPPH法测定抗氧化活性

采用DPPH法测定黄芩苷清除自由基能力，反应系统中的抗氧化剂可以和DPPH的单电子进行配对而使 517 nm检测波长降低，因此，可根据517 nm的变化来检测自由基的清除情况，从而评价供试药液的抗氧化能力。黄芩水提取液（溶于DMSO中）设置8个浓度梯度，分别为10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400 μmol/L。首先将1 mL 100 mmol/L醋酸钠缓冲液（pH值5.5）、 0.1 mL 3 mmol/L 的DPPH乙醇溶液和1.87 mL乙醇放入小型离心管中。再将0.03 mL不同浓度配制好的黄芩水提取液加入离心管中，轻晃摇匀，置25 ℃恒温培养箱中反应20 min后，于517 nm处测量其吸光度，所得结果记为A1。空白组只加入0.03 mL DMSO，其吸光度记为A2。对照组加入0.03 mL DMSO和0.1 mL l3 mmol/L 的DPPH乙醇溶液，所得结果记为A3。自由基的清除率是用吸光度来表示，吸光度减少，代表DPPH分子减少。清除率的计算公式为：清除率（%）=1-（A1-A2）/A3×100%。

2.6   细胞内化学成分的变化

通过检测细胞内容物的渗漏来检测细胞内化学成分的变化，以检测黄芩水提取物对被测细菌细胞膜和细胞壁的破坏能力。将适量药液加入植物软腐病菌菌悬液中，使其最终质量浓度为1 MIC，作为一个试验数据处理组;等量不含药液的菌悬液作为研究空白对照组。将以上液体培养基于33 ℃、180 r/min摇床中恒温培养20 h后，各吸取2 mL 进行高速离心（5 000 r/min，10 min），弃去上清液收集菌体;菌体用无菌生理盐水经离心洗涤两次，在常温干燥箱里烘干，4 ℃条件下保存备用。分别于16 h、24 h在260 nm处测定细胞内容物的释放。

3   结果与讨论

3.1   结果

（1）黄芩抑菌圈平均直径为12 mm。植物软腐病菌对黄岑水提取液具有中度敏感性，黄芩水提取物对植物软腐病菌有一定的抑菌作用。

（2）最小抑菌浓度（MIC）的测定表明，黄芩水提取液对植物软腐病菌最低抑菌浓度为 0.031 25 g/mL。

（3）最小杀菌浓度（MBC）的测定表明，黄芩水提取液对植物软腐病菌最低杀菌浓度为0.062 5 g/mL。

（4）試验结果显示，光谱图中菌体加入药物前后的红外吸收光谱非常相似，在药物作用16 h和24 h后，1 400.35 cm-1处的峰值明显降低，对应于脂质和蛋白质中甲基的不对称伸缩振动及胞嘧啶C-鸟嘌呤A对的C-N振动。如果试验变量均匀，通常降低的峰值高度（即强度）降低，其中，所述官能团部分变小。说明药物作用后植物软腐病菌的细胞膜及细胞壁大部分被完全破坏，导致这些细胞主要内容物质发生渗漏，表明黄芩水提取液对植物软腐病菌的细胞膜和细胞壁均有严重影响。

（5）试验结果表明，黄芩具有较强的DPPH清除能力，且其随着药液浓度的加大而增强。当浓度达到100 μmol/L时， 清除率接近50%;浓度为400 μmol/L时，其抑制率高达91%。

3.2   讨论

黄芩作为我国常用中药之一，药理作用广泛，具有显著的抗菌抗氧化作用和重要的临床应用价值，需求量大，所含化学组成成分和分析作用广。从试验中可以得出黄芩水提取物对植物软腐病菌有明显的抑菌作用。

与传统抗生素相比，中药具有多靶点、不易产生耐药性等优势。今后应在充分挖掘黄芩潜在药理作用的同时，还要注重考虑黄芩及其有效组分药理活性及具体作用机制，积极发现并利用一些尚未被发现的活性组分。

参考文献：

[ 1 ] 刘雄，高建德.黄芩研究进展[J].甘肃中医学院学报，2007（2）：46-51.

[ 2 ] 马建凤，刘华钢，朱丹.中药体外抑菌研究的方法学进展[J].药物评价研究，2010，33（1）：42-45.

[ 3 ] 张咪，黄欣玥.黄芩提取物对耐药性金黄色葡萄球菌的抑制作用研究[J].化学工程与装备，2018（10）：32-33.

[ 4 ] 孙长贵，张丽君，曾贤铭，等.微量稀释法测定抗真菌剂对酵母菌MIC的评价[J].临床检验杂志，2000（6）： 331-332，335.

[ 5 ] 晋兴，武爱荣，黄波，等.用纸片扩散法和微量稀释法进行药物敏感性测定的比较[J].国际检验医学杂志，2014，35（3）：322-324.

（编辑：刘佳欣）