miR-2861在食管鳞癌患者血清中的表达及临床意义

史露宾，李世宝，彭晴，毛逸琪，马萍(.徐州医科大学医学技术学院，江苏徐州000；.徐州医科大学附属医院检验科，江苏徐州000)

中国作为食管癌高发地区之一，发病率和死亡率均高于世界平均水平[1]。根据其组织来源不同，可将其分为食管鳞癌(ESCC)和食管腺癌(EAC)，在我国ESCC患者占比超过90%，且预后较差，5年生存率不足20%[2]。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖类抗原19-9(carbohydrate antigen19-9，CA19-9)作为目前临床上常用的食管癌的诊断和预后标志物，其敏感性和特异性均较低。因此，急需一种敏感性较高且容易获得的新型标志物以提高ESCC早期检出率。研究证实，miR-2861在多种肿瘤中发挥着重要的作用，例如乳头状甲状腺癌[3]，宫颈癌[4]，肺癌[5]等。然而，其在食管癌中的报道少见。本研究检测了miR-2861在ESCC患者血清中的表达水平，分析了其与患者临床病理参数的关系，并且评估其对ESCC的诊断效能，以期为ESCC诊断提供新的肿瘤标志物。

1 材料与方法

1.1一般资料 收集2018年9月至2019年6月徐州医科大学附属医院消化内科、胸外科就诊的食管癌患者49例，男41例，女8例，年龄(66.0±8.4)岁。纳入标准：(1)均经病理组织活检证实为ESCC；(2)入组前未经手术、放疗、化疗等治疗；(3)临床资料完整。排除标准：(1)合并其他肿瘤者；(2)患有严重心、肺、肾、神经系统等疾病；(3)患有严重精神疾病者。临床分期：按国际抗癌联盟 (UICC)第七版TNM标准分期分为T1/T2期24例，T3/T4期25例；肿瘤大小：≥5 cm 22例，<5 cm 27例；存在淋巴结转移21例，无淋巴结转移28例；存在神经侵犯21例，无神经侵犯28例；分化程度：高分化18例，中、低分化31例；肿瘤标志物(包括CEA、CA19-9、CA125、CA72-4、SCCA)升高：是15例，否34例。收集同期于本院消化内科就诊的食管良性疾病(主要为食管良性肿瘤、食管炎)患者36例，患者均经内镜检查确诊，男31例，女5例，年龄(52.9±12.6)岁；另收集同期在本院体检健康者48例作为健康人对照组，男39例，女9例，年龄(66.8±7.8)岁，各组的年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经徐州医科大学附属医院医学伦理委员会批准(XYFY2021-JS004-01)，患者均知情同意。

1.2主要仪器及试剂 TRIzol Universal总RNA提取试剂(北京天根生化科技公司)，逆转录试剂盒(上海同科生物科技公司)，PCR试剂盒(广州锐博生物技术公司)。Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR仪(美国ABI公司)，NanoDrop 1000分光光度计(美国Thermo公司)。

1.3标本采集 使用含有分离胶的促凝采血管采集各研究对象住院时(体检健康者于体检时采集)的空腹静脉血5 mL，2 h内于4 ℃、4 000 r/min离心10 min，吸取上层血清，置于无RNase的EP管中，样本置-80 ℃保存。

1.4RNA提取及逆转录反应 按照TRIzol Universal总RNA提取试剂说明书提取血清总RNA，紫外分光光度计检测及浓度及纯度，选取吸光度(A260/280 nm)在1.8～2.0的样本用于后续实验。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，标本置于-20 ℃保存。

1.5引物设计及实时荧光定量PCR 根据GenBank中miR-2861和内参U6基因的序列号(分别为NR_037217和NR_138085)，用Primer Premier 5.0软件设计引物，并送广州锐博生物技术公司合成[6]。miR-2861上游引物序列：5′-CCTCTGCAGCTCCGGC-3′，下游引物序列：5′- CTCTTCCGGTCTCCGCCC-3′，退火温度60 ℃，产物片段大小82 bp。U6上游引物序列：5′-TAGGGAGACAGGGTGCTGAA-3′，下游引物序列：5′-AAAGCCCTTCAGGATACCGC-3′，退火温度60 ℃，产物片段大小94 bp。荧光定量PCR反应体系为20 μL，包括：2×SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。循环参数：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 34 s，共50个循环。用PCR仪配套的LightCycler®96分析软件在70～95 ℃采集荧光信号。每个样本设置3个复孔，以U6为内参照。结果以Ct值表示，miR-2861的相对表达水平以2-△△Ct法计算。公式：ΔΔCt=[(实验组Ct目的基因-实验组Ct内参基因)-(健康人对照组Ct目的基因-健康人对照组Ct内参基因)]。

2 结果

2.1miR-2861在各组血清样本中的表达水平 miR-2861在49例ESCC患者(8.34±7.81)、36例食管良性疾病患者(8.89±7.98)及48例体检健康者(1.71±1.70)血清标本中的表达水平差异有统计学意义(F=13.42,P<0.001)，进一步进行组间两两比较结果表明，ESCC组血清miR-2861相对表达量与良性疾病组比较差异无统计学意义(t=5.677,P>0.05)，但食管癌组较健康人对照组明显升高，差异有统计学意义(t=1.310,P<0.01)。

2.2血清miR-2861的表达与ESCC患者临床病理参数的关系 以ESCC患者血清miR-2861相对表达量的中位数(5.23)为分界，将其分为高表达组(31例)和低表达组(18例)，分析两组与ESCC患者临床病理参数的关系。结果发现miR-2861的表达水平与年龄、性别、淋巴结转移、神经侵犯、分化程度、肿瘤标志物升高均无显著相关性(P>0.05)，但与分期、大小有关(P<0.01)。见表1。

表1 血清miR-2861的表达与ESCC患者临床病理参数的关系

2.3miR-2861对ESCC的诊断效能评估 ROC曲线结果显示，血清miR-2861诊断ESCC的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.67(95%CI:0.58～0.76)，当cut-off值为1.584时，其敏感性为87.5%，特异性为49.41%。见图1。

图1 miR-2861对ESCC诊断的ROC曲线

3 讨论

研究表明，miRNA在食管癌组织或细胞系中的表达谱与正常组织或细胞中的表达谱存在明显差异，为食管癌诊断提供了重要的参考价值[7]。不同种类的miRNA在食管癌中的表达水平可能升高或者下降，有望成为食管癌诊断的生物学标志物。例如，miR-7在食管癌患者血清标本中呈低表达，并且其表达与淋巴结转移和肿瘤大小有关，表明血清miR-7可能作为食管癌诊断的无创生物学标志物[8]。与之相反的是，Lin等[9]通过比较101例食管癌患者与97例健康人血浆中miR-34a的表达水平，结果发现食管癌患者血浆miR-34a的表达上调，并且在早期食管癌诊断中敏感性及特异性均较高。

本研究通过实时荧光定量PCR检测证实了miR-2861在ESCC患者血清标本的表达水平明显升高，其可能作为致癌基因在ESCC中发挥作用。此外，本研究还发现，miR-2861在ESCC组与食管良性疾病患者中的差异无统计学意义(P>0.05)，分析原因可能与纳入的食管良性疾病患者数量较少有关。笔者通过分析miR-2861的表达与ESCC患者临床病理参数之间的关系，发现miR-2861水平与分化程度和肿瘤大小明显相关(P<0.05)。在诊断效能方面，Zheng等[10]通过ROC曲线评估miR-155在食管癌诊断中的临床价值，结果发现其诊断食管癌的AUCROC为0.870，敏感性和特异性分别为83.5%和77.5%，是食管癌患者总生存期的1个独立预测因子，并且可作为ESCC潜在的诊断标志物。本研究以食管良性疾病+体检健康者为对照组，以ESCC为疾病组，采用ROC曲线评估其诊断ESCC的临床效能，结果发现其敏感性为87.5%，特异性为49.41%，表明miR-2861有望作为ESCC潜在的新型诊断标志物。

本研究尚存在一些不足之处，例如由于实验时间有限以及随访困难，目前尚未对食管癌患者进行跟踪采血检测miR-2861的变化水平，也并未在细胞水平检测miR-2861的表达，并分析其生物学功能。下一步我们将扩大样本量，收集患者随访资料分析预后信息，通过生物信息学方法预测并验证miR-2861潜在的靶基因以及可能参与的信号通路，同时进行体外和体内实验深入研究miR-2861在ESCC中的发病机制，为个性化治疗提供依据。