血浆Septin9基因甲基化检测在胃肠道病变中的临床应用价值评价

王炳龙，汤纪丰，俞子晴，江仁权，何毓珏，林锦骠，欧启水(福建医科大学附属第一医院检验科，福建医科大学基因诊断研究中心，福建省检验医学重点实验室，福州 350005)

血浆甲基化Septin9基因(methylatedSeptin9, mSeptin9)检测是近年来开展的检验项目，在临床实践中主要作为一种无创辅助诊断结直肠癌的方法。作为一种表观遗传的修饰形式，mSeptin9已被证实与多种肿瘤有关[1]，特别是在结直肠癌和胃癌的发生、发展过程中关系密切[2]。然而，mSeptin9基因在许多良性病变中也可被检出，其在许多疾病中的病理机制和临床应用价值有待进一步明确。本研究通过回顾性收集2017年5月至2020年11月本院就诊的消化系统恶性肿瘤和良性病变(主要为胃肠道病变)患者检测血浆Septin9甲基化的病例信息，分析血浆Septin9基因甲基化检测的临床应用价值，以期为进一步指导临床实践，探讨mSeptin9的潜在致病机制提供依据。

1 资料与方法

1.1研究对象 回顾性收集2017年5月至2020年11月在福建医科大学附属第一医院检验科检测血浆Septin9基因甲基化的所有病例，经筛选纳入诊断为消化系统疾病的患者共2 067例，其中包括1 751例消化系统恶性肿瘤患者(1 276例恶性肿瘤根治术术前的患者和475例术后7 d内的结直肠癌和胃癌患者)以及316例消化系统良性病变患者(主要包括结直肠炎35例、结直肠息肉56例、肠梗阻29例和胃炎107例等，其诊断均符合相应的诊断标准，病理结果排除恶性病变)，另纳入20例非消化系统良性病变患者(病理结果排除恶性病变，同时未有证据表明存在消化系统疾病)和41例无疾病证据受检者作为对照组，同时收集所有纳入者的相关临床资料。其中，男性1 339例，女性789例；年龄13～93岁，中位年龄62岁。单因素回归分析显示，各组之间性别构成对Septin9甲基化的检测结果无影响(P>0.05)，除消化系统良性病变患者(OR=1.037 9，95%CI：1.012 3～1.064 1，P=0.002)和术后结直肠癌和胃癌患者(OR=1.027 9，95%CI：1.008 9～1.047 3，P=0.003 1)外，各组年龄对Septin9甲基化检测结果无影响(P>0.05)。病例纳入标准：(1)所有疾病的诊断均经病理确诊且符合相应的诊断标准；(2)均为原发性肿瘤。排除标准：(1)合并其他原发性恶性肿瘤患者；(2)怀孕或哺乳期女性；(3)自身免疫病患者；(4)合并人免疫缺陷病毒感染者。本研究经福建医科大学附属第一医院伦理委员会审核批准(批准文号：闽医大附一伦理医技审[2015]084号及闽医大附一伦理医技审[2015]084-1号)，各研究对象知情同意。

1.2主要仪器及试剂Septin9基因甲基化检测试剂盒(PCR荧光定量法，北京博尔诚科技公司)，QuantStudio DX实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，罗氏E801电化学发光仪(瑞士罗氏公司)。癌胚抗原(CEA)测定试剂盒、糖类抗原(CA)125检测试剂盒、CA 72-4测定试剂盒、CA 19-9测定试剂盒、甲胎蛋白(AFP)检测试剂盒(电化学发光法，瑞士罗氏公司)。

1.3标本采集 术前患者于住院第一天采集，术后患者于手术后7 d内采集，无疾病证据受检者为体检人群体检时采集。检测时采集晨起空腹(禁食8～12 h)静脉血10 mL，EDTA-K2抗凝，1 350×g离心12 min，重复1次，获取3.5 mL血浆；同时另采集静脉血2 mL，促凝胶促凝，2 800×g离心8 min，获取2 mL血清。

1.4血浆Septin9基因甲基化检测 所有检测均在福建医科大学附属第一医院检验科完成。取上述血浆标本，按照Septin9基因甲基化检测试剂盒(PCR荧光探针法)说明书操作。步骤如下：(1)获取3.5 mL血浆后，对血浆进行裂解、磁珠富集DNA、洗涤、洗脱DNA，将提取的DNA使用亚硫酸盐进行转化；(2)将转化成功后的DNA加入PCR预反应液(含dNTPs、10×PCR Buffer、引物、探针、阻断剂以及Taq DNA聚合酶，单个反应的反应体系为60 μL，其中30 μL PCR预反应液和30 μL DNA样本)中进行PCR反应，反应条件:94 ℃活化20 min；62 ℃ 5 s，55.5 ℃ 35 s，93 ℃ 30 s，45次循环;40 ℃ 5 s。结果判断：在内参基因β-肌动蛋白(β-actin)结果正常的情况下，Ct值≤41.0时结果判为阳性，Ct值>41.0或无Ct值时结果判为阴性。每次实验均设阳性和阴性对照，阳性和阴性对照均由试剂盒提供，处理方法及流程与受检者相同。

1.5CEA、AFP、CA19-9、CA12-5和CA72-4检测 采用电化学发光法，取上述血清标本按照罗氏E801全自动电化学发光仪及配套的试剂盒说明书操作。CEA参考范围为0～5.2 ng/mL(吸烟者0～6.5 ng/mL)；AFP参考范围为0～13.6 ng/mL；CA19-9参考范围为0～34 U/mL；CA12-5参考范围为0～35 U/mL;CA72-4参考范围为0～6.9 U/mL。

1.6统计学分析 数据的分析使用SPSS 20.0软件、MedCalc软件和SPSSAU 20.0 在线工具进行。对计数资料比较采用列联表χ2检验或Fisher确切概率法；对有等级的计数资料采用Ridit分析；使用单因素Logistic回归分析判断年龄和性别对血浆Septin9基因甲基化检测结果是否有影响；绘制ROC曲线分析血浆Septin9基因甲基化检测的诊断价值，多因素Logistic回归分析筛选联合诊断指标并计算预测概率。所有假设检验比较均为双侧，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1血浆Septin9基因甲基化在各组中的表达水平 在所有未经手术治疗的病例中，消化系统恶性肿瘤患者共1 276例，占总病例的77.19%。在消化系统恶性肿瘤组和相应部位良性病变组血浆Septin9基因甲基化检测阳性率的比较中，胃癌(共302例，阳性检出132例，阳性率43.71%)、肝癌(共9例，阳性检出7例，阳性率77.78%)和结直肠癌组(共928例，阳性检出536例，阳性率57.76%)的阳性率均高于相应部位的良性病变组(P<0.01)。在消化系统疾病组和无疾病证据受检者组(共41例，阳性检出2例，阳性率4.88%)Septin9基因甲基化检测阳性率的比较中，胃癌、肝癌、胰腺癌(共5例，阳性检出3例，阳性率60.00%)、回盲部恶性肿瘤(共10例，阳性检出7例，阳性率70.00%)、结直肠癌、肠梗阻(共29例，阳性检出8例，阳性率27.59%)和结直肠息肉组(共56例，阳性检出12例，阳性率21.43%)的阳性率均增高(P<0.05)。见表1。

表1 血浆Septin9基因甲基化在各组受检者中的检测结果分析

2.2血浆Septin9基因甲基化检测结果与患者的临床病理参数关系 收集经病理确诊的结直肠癌和胃癌患者，分析血浆Septin9基因甲基化检测结果与临床病理参数的关系，结果见表2。在结直肠癌患者中，临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、存在区域淋巴结转移和远处转移的患者血浆Septin9基因甲基化阳性率较高，差异有统计学意义(P<0.01)；而不同年龄、性别、分化程度、病理分型和肿瘤位置的患者在血浆Septin9基因甲基化的阳性率比较均无统计学意义(P>0.05)。在胃癌患者中，Ⅲ～Ⅳ期和存在远处转移的患者血浆Septin9基因甲基化阳性率较高，差异有统计学意义(P<0.001)；而不同年龄、性别、分化程度、病理分型、肿瘤位置及是否存在区域淋巴结转移对胃癌中血浆Septin9基因甲基化阳性率的比较均无影响(P>0.05)。

表2 血浆Septin9基因甲基化检测结果与结直肠癌和胃癌患者的临床病理参数关系

2.3血浆Septin9基因甲基化检测在结直肠癌和胃癌中的ROC曲线分析 绘制ROC曲线并对结直肠癌组与结直肠良性病变组或无疾病证据受检者组，胃癌组与胃良性病变组或无疾病证据受检者组逐一进行分析，结果显示血浆Septin9基因甲基化检测在以上各组中的ROC曲线下面积(AUCROC)分别为0.681、0.764、0.649和0.694，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3、图1A。同时，血浆Septin9基因甲基化在结直肠癌和胃癌中与传统肿瘤标志物CEA、AFP、CA19-9、CA12-5、CA72-4阳性率的比较中，其阳性率均高于其他肿瘤标志物(P<0.01)。见表4。联合指标ROC曲线分析表明，在结直肠癌与结直肠良性病变组中，Septin9联合CEA检测能将AUCROC提高至0.789(P<0.01)，并将敏感性提高至70.88%。见表3、图1B。胃癌组中未发现联合其他诊断指标能改善血浆Septin9基因甲基化检测的诊断价值(P>0.05)。

表3 血浆Septin9基因甲基化检测在不同组别中的诊断价值

图1 血浆Septin9基因甲基化检测在结直肠癌和胃癌中的ROC曲线分析

表4 血浆Septin9基因甲基化与多种肿瘤标志物阳性率的比较

2.4结直肠癌和胃癌患者手术前后血浆Septin9基因甲基化检测阳性率的比较 分别比较928例恶性肿瘤根治术术前行血浆Septin9基因甲基化检测与318例术后7 d内行该检测的结直肠癌患者、302例术前行该检测与157例术后行该检测的胃癌患者的阳性率，结果显示各组术后血浆Septin9基因甲基化的阳性率(结直肠癌31.45%，胃癌33.76%)均低于术前(结直肠癌57.76%，胃癌43.71%)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。同时，收集所有术前检测结果为阳性且术后半年内又行该检测的患者资料作进一步分析，结果表明，在结直肠癌和胃癌患者中术后血浆Septin9基因甲基化的阳转阴率分别为63.33%和69.23%，且存在远处转移的结直肠癌患者的转阴率明显低于未转移者，差异有统计学意义(P<0.01)。见表6。

表5 结直肠癌和胃癌患者手术前后血浆Septin9基因甲基化检测结果的比较

表6 血浆Septin9基因甲基化检测阳性的结直肠癌和胃癌患者手术前后检测结果的比较

3 讨论

Septin9基因的异常调节和改变参与了多种肿瘤的发生、发展。该基因的异常甲基化已成为多种肿瘤的重要生物学特征，对Septin9甲基化状态的测定亦已用于多种肿瘤的诊断[3]。在临床实践中，Septin9基因甲基化检测已广泛开展，但其诊断价值在不同的研究中存在差异[4]。因此，本研究拟通过大样本回顾性分析血浆Septin9基因甲基化检测在消化道病变中的诊断价值，为临床提供参考。

我们的回顾性研究表明，血浆Septin9基因甲基化在术前结直肠癌患者中阳性检出率为57.67%，这与冷霞等[5]报道的52.10%阳性率以及与张春燕等[6]报道的62.50%阳性率基本一致，但低于赵媛等[4]报道的70%～90%阳性率。在术前胃癌患者中该检测阳性率为43.70%，接近贺娜等[7]报道的46.90%阳性率和褚文慧等[8]报道的40.52%阳性率。同时，本研究结果显示血浆Septin9基因甲基化在结直肠癌和胃癌中的检验效能均高于CEA、CA19-9和CA12-5等肿瘤标志物。比较各研究的差异发现，本研究中使用的检测方法和患者纳入标准与冷霞等[5]十分相似。与其他研究者在阳性检出率上的差异可能源于标本来源、检测方法、患者的治疗情况以及样本量大小的不同。相较其他研究，本研究的优势主要体现在统计的样本数量更大以及更接近患者在临床实践中的真实受检状态。另外，肝癌(7/9，77.80%)和回盲部恶性肿瘤(7/10，70.00%)的阳性检出率结果表明Septin9基因甲基化检测有望进一步成为其他消化道肿瘤的辅助诊断指标。

在消化系统良性病变中，我们发现血浆Septin9基因甲基化的阳性率也增高(P=0.036)。ROC曲线分析表明，良性病变中其阳性率的增高降低了良性病变与恶性肿瘤的鉴别能力。结合其他肿瘤标志物联合诊断(如在结直肠癌中结合CEA)能够改善Septin9基因甲基化检测的诊断效能。病理机制上，Septin9基因甲基化阳性率在良性病变中增高是否会促进病变从良性向恶性转变有待进一步研究。同时，血浆Septin9基因甲基化阳性检出率在Ⅲ～Ⅳ期的结直肠癌和胃癌患者及术前状态患者中较高，证明了其甲基化程度与恶性肿瘤的进展和存在有着重要联系，其甲基化程度可能是提示疾病进展、监测手术效果和患者预后评价的潜在标志物。

在目前的临床实践中，血浆Septin9基因甲基化检测的使用具有一定的局限性。比如，检测Septin9的费用较高，操作繁琐；在无症状肿瘤患者中敏感性低[9]，限制了该检测在肿瘤早期筛查中的应用价值等。本研究的局限性主要为缺乏队列研究，难以进一步评价Septin9甲基化状态与预后和疾病进展之间的联系。综上，血浆Septin9基因甲基化检测在结直肠癌和胃癌中具有诊断价值，在临床实践中结合其他诊断方法可提高其诊断效能。此外，Septin9基因甲基化与肿瘤进展存在相关的特性，表明其检测在提示肿瘤进展、评价手术效果、评估患者预后上具有广泛的应用前景，但需要更多的医学研究支持。