老年性白内障与MTHFR基因、同型半胱氨酸及B族维生素的相关性

罗军,杨渝伟(绵阳市中心医院检验科，四川绵阳 635000)

随着人口老年化，老年性白内障成为全球视力损害乃至致盲的首要原因[1]。大量研究证实，蛋氨酸代谢对维持晶状体透明度十分重要，尤其是代谢过程中亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)及其产物——同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)与老年性白内障密切相关[2]。HCY代谢副产物——同型半胱氨酸硫内酯可引起晶状体蛋白发生N-同型半胱氨酸化，从而引起结构和溶解度改变，最终导致白内障[3]。最近研究发现，MTHFRC677T单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)可严重影响MTHFR酶活性，进而影响HCY和叶酸(folic acid, FOL)的代谢[4]。然而，目前MTHFR基因多态性与老年性白内障的研究报道少见。因此，本研究纳入MTHFR酶的重要代谢物质——维生素B12(vitamin B12, VitB12)、VitB6、FOL和HCY，重点评估MTHFR基因多态性与老年性白内障的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2019年1月至2020年6月绵阳市中心医院就诊的663例老年性白内障患者作为疾病组，其中男312例，女351例，年龄51～88岁，中位年龄69岁。并于同期随机选择646例体检健康者作为健康人对照组，其中男308例，女338例，年龄50～93岁，中位年龄67岁。受试者均按照国际指南诊断标准[5]进行眼科检查，包括视力、裂隙灯和眼底检查。纳入标准：汉族；年龄50岁以上；视力<0.7；老年性白内障患者晶状体发生变性和浑浊，但无其他眼科疾病；健康人对照无白内障症状和体征，以及其他眼科疾病。排除标准：严重的肝肾疾病、冠心病、糖尿病、风湿性疾病、癌症及脑血管疾病等，以及服用抗癫痫药物、免疫抑制剂等导致HCY增高的药物。两组间的年龄(t=0.818,P=0.414)及性别(χ2=0.050,P=0.823)差异无统计学意义。本研究经绵阳市中心医院医学伦理委员会审批(批准文号：S-2018-085)，各研究对象均知情同意。

1.2仪器与试剂 QuantStudio实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，Cobas 6000全自动生化分析仪(德国罗氏公司)，ARCHITECT i2000化学发光免疫分析仪及配套试剂(美国雅培公司)，EXT 9050MD超高效液相色谱串联质谱检测系统及配套试剂(济南英盛生物公司)，EDTA-K2和SSTTM ⅡAdvance真空采血管(美国BD公司)，MTHFRC677T基因型检测试剂盒(西安金磁纳米生物公司)，HCY检测试剂盒(四川迈克生物公司)。

1.3方法

1.3.1样本采集 所有受试对象(体检健康者于体检时)均在治疗前，于清晨空腹状态下，分别用EDTA-K2和SSTTM ⅡAdvance真空采血管采集静脉血2.0 mL和5.0 mL，充分混匀。EDTA-K2管内的全血样本用于MTHFRC677T基因型检测，若不能及时检测,置于2～8 ℃保存不超过7 d；SSTTM ⅡAdvance真空采血管静置约30 min，2 000×g离心10 min，分离血清，在4 h内完成HCY、FOL、VitB12和VitB6检测。

1.3.2MTHFRC677T基因型检测 采用地高辛标记PCR-抗地高辛标记金磁微粒层析法，严格按照试剂说明书进行检测。结果判读标准：等位基因C和T分别扩增，扩增产物通过地高辛-抗地高辛结合，或与金磁微粒结合，然后在2个独立的层析系统中进行层析，根据检测线是否出现条带，判读C677T位点的基因型。若仅等位基因C层析系统出现条带，则为CC基因型；若仅等位基因T层析系统出现条带，则为TT基因型；若等位基因C和T层析系统均出现条带，则为CT基因型。

1.3.3血清各指标检测方法 血清HCY测定采用同型半胱氨酸甲基转移酶/S-腺苷同型半胱氨酸水解酶循环法，用Cobas 6000全自动生化分析仪检测；血清FOL测定采用钌标叶酸结合蛋白竞争法，用ARCHITECT i2000化学发光免疫分析仪检测；血清VitB12和VitB6测定采用质谱分析法，用EXT 9050MD超高效液相色谱串联质谱检测系统检测。所有项目均严格按照操作说明书进行。参考范围：HCY≤15 μmol/L；FOL：3.1～20.5 ng/mL；VitB12：0.1～2.1 ng/mL；VitB6：2～25 ng/mL。

1.4统计学分析 采用SPSS 19.0和MedCalc医学统计软件进行统计学分析。计量资料以中位数(四分位数)[M(P25,P75)]表示，组间比较采用Mann-Whitney秩和检验，多组独立样本的比较采用单因素方差分析，采用Jonckheere-Terpstra趋势分析各指标与不同基因型的相关性，用多元Logistic回归分析基因型或老年性白内障的风险因素；计数资料用百分比表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1疾病组与健康人对照组MTHFR单核苷酸多态性的比较MTHFRC677T位点TT、CT和CC基因型的分布频率在疾病组中分别为23.08%(153/663)、52.34%(347/663)、24.58%(163/663)，符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ2=0.773，P=0.679)；在健康人对照组中分别为16.10%(104/646)、46.90%(303/646)、37.00%(239/646)，亦符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ2=0.122，P=0.941)；但两组间CC(χ2=10.094,P=0.002)、CT(χ2=3.870,P=0.049)和TT(χ2=23.701,P<0.001)基因型分布频率的差异具有统计学意义。此外，C667T突变率在疾病组和健康人对照组中分别为49.25%(653/1 326)和39.55%(511/1 292)，两组间差异具有统计学意义(χ2=24.910,P<0.001)。

2.2疾病组与健康人对照组血清HCY、FOL、VitB12和VitB6水平比较 经Mann-Whitney检验，疾病组HCY水平显著高于健康人对照组(P<0.001)，而FOL、VitB12和VitB6显著低于健康人对照组(P<0.001)。见表1。然而，在两组内部进行不同性别之间的差异分析，结果发现在健康人对照组中上述4项指标水平均无性别差异(P均>0.05)，在疾病组中除VitB6(Z=1.134,P=0.257)外，男性患者HCY水平明显升高(Z=9.882,P<0.001)，而FOL和VitB12水平下降明显(Z分别为-5.624和-6.968,P均<0.001)。见表2。

表1 两组血清HCY、FOL、VitB12和VitB6水平比较[M(P25,P75)]

表2 两组血清HCY、叶酸、VitB12和VitB6水平的性别差异比较[M(P25,P75)]

2.3不同MTHFR基因型亚组间血清HCY、FOL、VitB12和VitB6水平比较 分别将所有受试者、健康人对照组和疾病组，按不同MTHFR基因型分成3个亚组，采用Jonckheere-Terpstra趋势分析HCY、FOL、VitB12和VitB6水平的变化趋势。结果发现，随着MTHFRC677T突变数增加(即CC→CT→TT)，无论是所有受试者，还是健康人对照组或疾病组，HCY水平均逐渐增加(Z分别为11.856、7.653和8.266，P均<0.001)，而FOL(Z分别为-8.443、-5.212和-10.634，P均<0.01)和VitB12(Z分别为-2.935、-2.226和-3.069，P均<0.01)水平均逐渐降低。见表3。

表3 不同MTHFR基因型亚组血清HCY、FOL、VitB12和VitB6水平比较

进一步进行多重比较发现，在所有受试者、健康人对照组和疾病组中，受试者TT基因型HCY(Z分别为13.322、8.169和8.559，P均<0.001)显著高于CT基因型，而FOL(Z分别为-6.683、-4.126和8.670，P均<0.001)和VitB12(Z分别为-3.251、-2.490和3.468，P均<0.001)显著低于CT基因型；但在CT基因型受试者中，HCY(Z分别为7.586、5.044和5.666，P均<0.001)高于CC基因型，FOL(Z分别为-6.302、-3.891和7.694，P均<0.001)低于CC基因型，而VitB12变化不显著(P均>0.05)。

2.4各观察指标与MTHFR基因突变和疾病发生的风险分析 经多元Logistic回归分析，对于MTHFR基因突变和老年性白内障，HCY(OR分别为1.18和1.24,P均<0.001)是危险因素，FOL(OR分别为0.91和0.95,P均<0.001)是保护因素；而VitB12水平与MTHFR基因突变无关联，却是老年性白内障的保护因素(OR=0.86,P=0.001)。校正年龄和性别后，结果与之类似；并且相比CC型，CT型和TT型受试者患老年性白内障风险增加(校正前：OR分别为1.68和1.84,P均<0.01；校正后：OR分别为1.62和1.76，P均<0.01)。见表4。

表4 MTHFR基因突变和疾病发生的多元Logistic回归分析

3 讨论

老年性白内障是一种多因素相互作用的疾病。据哈佛大学一项对4 500万人24年跟踪调查报道表明，年龄是老年性白内障的决定性影响因素，而环境和遗传因素则是主要的致病诱因[6]。此外，环境因素，如高强度的紫外线，太亮、太暗、炫光、反光的周围环境，以及密闭工作环境内化学毒物的影响，均可导致年龄相关性白内障发病时间提前。近年来研究发现，遗传因素与年龄相关性白内障密切相关，如着色性干皮病基因D、8-氧鸟嘌呤糖基酶-1基因和MTHFR基因多态性[7-8]。但迄今为止，国内外相关报道较少，且尚存争议。有学者认为MTHFRC677T多态性的CC和TT基因型具有保护作用[8]；但也有学者认为，MTHFRC677T多态性的CT/TT基因型与皮质性白内障风险增加独立相关[9]。本次试验发现，老年性白内障患者MTHFRC677T等位基因中，TT型和CT型均明显高于健康人对照；此外，相比CC型患者，CT型和TT型患者老年性白内障风险明显增加。

本研究首先探讨了MTHFR基因多态性与FOL/HCY代谢的关系。MTHFR所编码的酶是FOL/HCY代谢中的关键酶[10]，其C677T基因多态性是指其677位点发生C(胞嘧啶)→T(胸腺嘧啶)突变。既往研究证实，此突变可导致其编码酶的活性和热稳定性下降[11]。受酶活性改变的影响，FOL/HCY代谢过程中相关物质的血清水平也将随之改变，主要包括VitB12、VitB6、FOL和HCY。本研究结果证实，MTHFRC677T基因突变与HCY及FOL水平有关，而VitB12和VitB6水平所受影响较小。表明MTHFRC677T突变导致了MTHFR所编码酶活性降低，引起HCY在体内积聚，进而发生高同型半胱氨酸血症；而FOL作为HCY代谢的重要底物，则因高同型半胱氨酸血症而消耗增加，呈现出FOL水平降低。至于同样参与了FOL/HCY代谢的VitB12和VitB6，本试验结果显示，二者降低均与MTHFRC677T基因突变无明显的关联，分析原因可能与其血液中含量较低，从而受到的影响较小，或者经食物补充和肠道吸收功能代偿等原因有关。此外，本研究还发现一些不同于既往报道[12]的FOL/HCY代谢特点，如老年性白内障患者血清VitB12和VitB6水平低于健康人对照，分析原因可能存在地域和饮食习惯差异；男性患者HCY水平显著高于女性患者，这可能与男性吸烟、过量饮酒等有关[13]。

本次试验在探讨MTHFR基因多态性与老年性白内障的关系的同时，还纳入了FOL/HCY代谢过程中的重要代谢物质作为影响因素。大量文献报道表明，FOL/HCY代谢与白内障关系密切。有学者发现，HCY可诱导内质网应激压力，引起细胞内质网稳态失衡和晶状体上皮细胞中活性氧产生，导致晶状体损伤[13]。另有研究证实，FOL可减轻HCY引起的氧化应激作用，减轻晶状体损伤[14]。本研究经多元Logistic回归分析证实，FOL/HCY代谢也与老年性白内障显著相关，其中HCY是引起老年性白内障的危险因素，而FOL和VitB12则是保护因素，这与国内外研究报道一致[13,15]。同时，本研究结果还显示，即使在校正了年龄、性别以及FOL/HCY代谢过程中的重要代谢物质的影响后，MTHFR基因多态性仍然是老年性白内障的潜在危险因素。国外研究报道，CT/TT基因型白内障患者中，仅33%归因于MTHFR基因多态性所致HCY升高的间接途径，而67%则归因于该基因多态性的直接遗传途径[9]。因此，建议在对老年人进行眼睛保健时，可纳入MTHFRC677T基因多态性检测，以识别白内障的发生风险。

尽管本研究证实MTHFRC677T基因多态性可能与老年性白内障有关，但本研究尚存在一定的局限性。例如，在本次试验过程中，所有环境因素(如紫外线照射、光照及毒物的影响等)难以评估而均未纳入，结果是否受到环境因素影响并未评估；除VitB12和VitB6外，其他营养物质(如维生素A、C、D、E和K1等)均已证实与年龄相关性白内障有关[12]，但受检测限制未纳入。因此，有必要进一步深入探讨。

综上所述，MTHFRC677T CT/TT基因型患者发生老年性白内障的风险增加，同时受MTHFR基因编码的酶活性降低的影响，HCY、FOL和VitB12水平改变均与老年性白内障的进展相关。因此，应常规将MTHFRC677T基因型检测纳入眼科保健项目，以判断白内障的发生风险；同时定期检测血清中HCY、FOL和VitB12水平，及时采取补充B族维生素、甜菜碱和N-乙酰半胱氨酸[8]等预防和治疗措施，可能有助于延缓老年性白内障的发生、发展。