经皮神经电针刺激对骨质疏松大鼠骨形态发生蛋白-2表达的影响

柏中喜，张 保，乔昱音，王 梦，崔 林

骨质疏松症是一种以低骨密度和骨组织微结构退化为特征的疾病。临床表现为髋部、手腕和椎骨骨折，但其他部位也有脆弱性骨折。骨质疏松症有多因素（遗传和环境条件相互作用）和多基因性遗传的特点。因此，骨质疏松症有所谓的“复杂特征”。双胞胎和家庭研究表明，50%～80%的骨密度变异是由遗传因素解释的[1]。尽管骨折风险也是强遗传性的，但与骨密度不完全相关，这表明骨密度和骨结构和（或）强度可能是受共同的和独特的遗传因素影响。近年来，候选基因已被检测与骨密度和骨质疏松性骨折的相关性。有研究表明，针刺可以通过改变骨质疏松模型动物的体质量、矿物密度和结构来增强骨强度，其主要激活Wnt-β-连环蛋白信号通路来影响骨形成和代谢，并调节骨保护素和受体活性[2-4]。骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）是肿瘤坏死因子蛋白的一种生长因子，它与骨组织代谢密切相关。BMP-2蛋白有诱导成骨潜能，调节软骨板生长，直接影响成骨过程[5]。本研究旨在探讨经皮神经电针刺激对骨质疏松大鼠的治疗效果，并从BMP-2方面探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取88只健康的4个月大雌性SD大鼠，平均体质量（260.35±20.44）g。鼠笼温度保持在（24±2）℃，自由接触标准大鼠食物和水，大鼠在实验前1周适应实验室条件。

1.2 动物分组及骨质疏松大鼠模型构建 手术前，所有大鼠禁食过夜，空白组（22例）不做任何处理；其余大鼠用腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，通过大鼠中线背侧切口单独行双侧剖腹术（假手术组，22例）或双侧卵巢切除术（模型组、电针刺激组，各22例）。假手术组只暴露双侧卵巢但不切除。造模后饲养13周，去卵巢大鼠骨质疏松模型成功建立，对电针刺激组大鼠进行经皮神经电针刺激干预：选取“肾俞”“脾俞”“三阴交”“足三里”穴位，去鼠毛，对针具及穴位进行常规消毒，将不锈钢毫针（规格：0.35 mm×13 mm）迅速刺入大鼠皮下适当深度，连接电针仪（断续波，频率设置2 Hz，刺激强度为1.0 mA），电针刺激每次为15 min，每日1次，连续治疗5 d，间隔2日，以21 d为1个疗程，共治疗3个疗程。

1.3 观察指标 ①离体骨组织骨密度检测：治疗期满后，处死大鼠，取椎骨、股骨，从靠近植入物顶端3个凹槽的髓骨区域中选择相同宽度的区域进行取样。采用双能X线骨密度仪（OsteoSys公司，韩国）测定大鼠左侧股骨及腰椎的骨密度，操作步骤严格按照仪器说明书进行。②第4腰椎压缩实验：将检测完骨密度的大鼠椎骨分离出第4腰椎，采用砂纸打磨第4腰椎的上下两侧，使其平整，置于加载平台上，保持椎体生理方向与加载方向一致；压头向下，向标本施加10 mm/min的加载速度，直至大鼠椎体碎裂，记录并计算最大载荷及弹性模量。③股骨三点弯曲试验：采用AGS-J系列精密电子万能材料实验机测定大鼠左侧股骨检测最大载荷及弹性模量：保持大鼠股骨头凹面朝下，在跨距17 mm的2个支撑点处放置股骨头端，压头置于股骨长度中间位置上方，向标本施加10 mm/min加载速度，直至大鼠股骨断裂，记录并计算最大载荷及弹性模量。④采用改良Mankin评分：采用改良Mankin评分综合评定大鼠骨组织形态及结构[6]。⑤Real-time PCR检测大鼠血清BMP-2、转化生长因子-β（transforming growth factor-β1, TGF-β1)表达水平：治疗期满后，使用RNeasy迷你试剂盒（上海碧云天公司，中国）分离总RNA。用EcoDry预混试剂盒（Takara株式会社，日本）合成cDNA是的。使用FastStart Universal SYBR Green Master Mix（罗氏公司，瑞士）在Stepone Plus实时PCR系统（应用生物系统公司，美国）进行Realtime PCR。计算BMP2、TGF-β1 mRNA相对值。

1.4 统计学处理 应用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析或者重复测量的方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 离体骨组织骨密度比较 模型组股骨、腰椎骨密度低于空白组及假手术组，电针刺激组高于模型组、低于空白组及假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；空白组与假手术组间差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 4组骨质疏松大鼠离体骨组织骨密度比较

2.2 第4腰椎压缩试验结果比较 第4腰椎压缩试验结果显示，模型组弹性模量、最大载荷低于空白组及假手术组，电针刺激组高于模型组、低于空白组及假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；空白组与假手术组间差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 4组骨质疏松大鼠第4腰椎压缩试验结果比较

2.3 股骨三点弯曲试验结果比较 股骨三点弯曲试验结果显示，模型组弹性模量、最大载荷低于空白组及假手术组，电针刺激组高于模型组、低于空白组及假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；空白组与假手术组间差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表3 4组骨质疏松大鼠股骨三点弯曲试验结果比较

2.4 Mankin评分比较 模型组Mankin评分高于空白组及假手术组，电针刺激组低于模型组、高于空白组及假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；空白组与假手术组间差异无统计学意义（P＞0.05）（表4）。

表4 4组骨质疏松大鼠Mankin评分比较

2.5 血清BMP-2水平比较 模型组受试大鼠血清BMP-2 mRNA相对值低于空白组及假手术组，电针刺激组高于模型组、空白组及假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；空白组与假手术组间差异无统计学意义（P＞0.05）（表5）。

表5 4组骨质疏松大鼠血清BMP-2水平比较

2.6 血清TGF-β1表达水平比较 模型组受试大鼠血清TGF-β1 mRNA相对值低于空白组及假手术组，电针刺激组高于模型组、空白组及假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；空白组与假手术组间差异无统计学意义（P＞0.05）（表6）。

表6 4组骨质疏松大鼠血清TGF-β1表达水平比较

3 讨论

骨质疏松症是根据《黄帝内经》中的中医理论，被认为是肾气不足引起的一种衰老和退行性疾病，从2000年前开始，针灸和草药被广泛应用于治疗。中医的角度上，疾病是由于人体生命能量“气”的流动停滞所致；穴位针刺刺激有助于恢复流动，进而促进气的稳态，使身体功能恢复正常，几乎所有的中医院都采用针灸治疗骨质疏松症[7-8]。与其他常规干预比较，针灸被认为是一种相对简单、廉价和安全的非药理学的治疗方法；然而，由于患者害怕针刺带来的疼痛和压力，不愿意接受针灸治疗。因此，电针刺激正逐渐成为针灸的替代品。电针刺激是一种有趣的低水平激光疗法，是一种无创的光疗法，被定义为低强度、非热激光照射对传统穴位的刺激[9-11]。治疗的无创性和无痛性使得它有助于为患者提供全面的医疗保健。尽管使用低水平、非热激光照射而不是针刺，但它与传统针刺的原理相同，并证明其生物效应与针刺相同。电针刺激作为一种低水平激光照射刺激穴位的干预手段，被认为是改善骨纵向生长的一种干预手段[12-13]。本研究采用经皮神经电针刺激对骨质疏松大鼠进行干预，发现治疗3个疗程后，实验大鼠骨密度、腰椎及股骨生物力学指标、Mankin评分均明显提升，证实经皮神经电针刺激治疗为有效治疗手段。

根据目前的骨骼生物学知识选择，许多候选基因已经被测试与骨密度和骨质疏松症有一定的相关性。BMP-2是位于染色体20p12上的生长因子，属于TGF-超家族[14]。BMP-2在早期胚胎发生、骨骼发育和位于成熟骨骼中的成骨细胞分化中起着关键作用。BMP-2的信号传导需要BMP-2分子与位于成骨细胞表面的BMP受体结合。BMPRS磷酸化细胞内蛋白可影响细胞内Smads信号和转录。BMP-2是骨发育和修复的关键介质，是骨折愈合的独特要求。BMP-2在启动和调节骨形成中的中心作用使得BMP-2表达水平与骨质疏松症有关的发现是合理的[15-17]。BMP-2基因也与骨关节炎有关，骨关节炎与骨质疏松症有着复杂的遗传关系。转基因小鼠和人类疾病的基因调控证实了了在骨和软骨形成和成人骨平衡过程中控制BMP信号水平的重要性[18-19]。归根结底，BMP-2在特定组织中的浓度至关重要，因为改变的水平可能导致发育异常或影响各种人类疾病的发病或进展。由此可以推断，检测体内BMP-2表达水平有助于疾病的诊疗及预后评估。为探讨经皮神经电针刺激治疗骨质疏松大鼠的作用机制，本研究采用RT-PCR测定大鼠血清BMP-2、TGF-β1表达水平，发现治疗期满后，电针刺激组大鼠血清BMP-2、TGF-β1 mRNA相对值明显升高，推断经皮神经电针刺激治疗骨质疏松可能是通过上调血清BMP-2表达水平实现的[20]。

综上所述，经皮神经电针刺激可能通过提高骨质疏松大鼠血清BMP-2表达水平，增强骨密度，可有效抑制骨质疏松与关节软骨退化。