抗菌肽Piscidin 1 PG/聚乳酸电纺纳米纤维膜的制备及其对海鲈鱼的保鲜作用

徐宇辰，励建荣，李婷婷，谢晶，劳敏军，王轰，郭晓华

（1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州121013）（2.大连民族大学生命科学学院，辽宁大连 116600）（3.上海海洋大学食品学院，上海 201306）（4.浙江兴业集团有限公司，浙江舟山 316120）（5.蓬莱京鲁渔业有限公司，山东烟台 265600）（6.山东美佳集团有限公司，山东日照 276800）

海鲈鱼学名鲈鱼，在我国黄海、渤海中广泛分布，富含蛋白质，不饱和脂肪酸，矿物元素等营养物质[1]。但海鲈鱼在冷藏运输过程中，由于鱼肉内蛋白含量高，使其在自身的酶解反应和微生物作用下极易产生胺类、硫化氢等有害物质，进而引起鱼肉的腐败变质，影响产品销售造成经济损失[2]。

抗菌肽是一种在宿主先天免疫系统中起着重要作用的小分子多肽。迄今，已有多种抗菌肽从动物、植物或细菌中分离出来[3,4]。抗菌肽Piscidin 1（Pis-1）是从杂交斑纹鲈鱼（Morone saxatilis×M.Chrysops）的肥大细胞中分离得到的[5,6]。Pis-1抗菌活性强，对细菌、真菌具有广谱抗菌性。它主要通过直接破坏细胞膜来发挥抑菌作用。但是，Pis-1会引起溶血并有细胞毒性，这极大地限制了它在食品保鲜中的使用[7,8]。研究发现将Pis-1第8个氨基酸处用脯氨酸（Pro）替换甘氨酸（Gly）后的Pis-1 PG在保留原有抗菌活性的同时具有了低细胞毒性和溶血活性，使其有望运用在食品保鲜中[9]。

聚乳酸（PLA）也称为聚丙交酯是由葡萄糖发酵得到的乳酸开环聚合而成，成本低且易生产，是目前最常用的生物可降解聚合物[4,10]。PLA已经被用来加工成食品的包装、容器、杯子和餐具等产品[10]。PLA由于物理性能、相容性、力学性能、热稳定性良好，使其常应用于静电纺丝技术中[11-13]。

腐败希瓦氏菌是一种产三甲胺（TMA）、氨（NH3）和二甲胺（DMA）等具有异味的胺类物质的特殊腐败菌[14]。腐败希瓦氏菌可在低温下生长，广泛分布于冷藏鱼产品中，已被证实是海鲈鱼在冷藏和冷冻过程中的优势腐败菌[15]。验证纺丝膜对腐败希瓦氏菌生长的影响对研究纤维膜包裹海鲈鱼鱼肉实验有很强的参考作用。

为了达到提高水产品安全性及延长保质期的目的，利用静电纺丝技术使聚合物与抗氧化剂、抑菌剂相结合来开发生物活性食品包装，有利于抑制鱼肉腐败和氧化[16-18]。本文选择抗菌肽Pis-1 PG作为抑菌剂，通过静电纺丝技术制备 Pis-1 PG/PLA复合纳米纤维膜。研究了抗菌肽Pis-1 PG的加入对PLA电纺纤维形态、分子结构、晶体结构、力学性能和对腐败希瓦氏菌生长的影响。最后，用Pis-1 PG/PLA纤维膜包裹海鲈鱼鱼肉，研究冷藏中Pis-1 PG/PLA纤维膜对鱼肉的菌落总数、pH、挥发性盐基氮总数（TVB-N）含量等保鲜指标来研究其保鲜效果。期望开发一种能有效延长海鲈鱼鱼肉冷藏期的包装方法，推广静电纺丝纤维膜的应用，为其他鱼类的保鲜提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

聚乳酸，分子量=100000，东莞市华创塑化有限公司；新鲜海鲈鱼，市售；N,N-二甲基甲酰胺（DMF），二氯甲烷（分析纯），北京索莱宝科技有限公司；LB营养肉汤、LB营养琼脂，青岛海博生物技术有限公司；Piscidin 1 PG（FFHHIFRPIVHVGKTIHRLVTG，纯度≥95%），生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

THZ-D台式恒温震荡器，太仓市实验室设备厂；SW-CJ-2FD超净工作台，苏景集团苏州安泰技术有限公司；SC-303型电子管电热恒温培养箱，浙江省嘉兴县新腾电器厂；85-2恒温磁力搅拌器，北京世纪科信科学仪器有限公司；PE Victor X3多功能酶标仪，美国铂金埃尔默仪器；ET-2535H型静电纺丝设备，北京永康乐业科技发展有限公司；S-4800型冷场发射扫描电子显微镜，日本日立公司；质构仪（XT plus），英国Stable Micro Systems公司；傅立叶变换红外光谱仪（Alpha-Centauri 560），美国 Nicolet公司；RigakuUltima IV型X射线粉末衍射仪，日本理学Rigaku公司；FOSS全自动凯氏定氮仪（KJELTEC 8400），上海瑞玢国际贸易有限公司。

1.3 静电纺丝纤维膜的制备

（1）制备PLA溶液。称取1.00 g的PLA溶于10 mL的二氯甲烷：N,N-二甲基甲酰胺=7:3溶液中，在恒温磁力搅拌器上搅拌3～4 h，直至PLA完全溶解，溶液呈现为具有一定黏度的透明液体。

（2）制备Pis-1 PG/PLA混合溶液。量取4.00 mg的Pis-1 PG加入到4 mL的PLA溶液中，溶液中Pis-1 PG的含量为1 mg/mL。在恒温磁力搅拌器上搅拌1～2 h，直至Pis-1 PG完全溶解，溶液最终为澄清透明的液体。

（3）静电纺丝。分别取PLA和Pis-1 PG/PLA混合溶液4 mL转移到5 mL注射器中，并放置到注射泵上。将铝箔纸裹在接收筒上，接收筒与针口间距 15 cm，注射器推进速率为0.75 mL/h，PLA溶液施加电压10 kV，Pis-1 PG/PLA混合溶液施加电压16 kV，进行静电纺丝。将所得纤维膜从铝箔纸上剥离后在真空干燥箱中25 ℃干燥过夜去除残留溶剂。

1.4 静电纺丝纤维的特性

1.4.1 形貌表征

将得到纤维膜切成5 mm×5 mm的薄片，经镀金处理后用扫描电镜观察其形貌特征，并使用 Image J软件测量电镜照片中的静电纺丝纤维直径，每个样品选择 50根静电纺丝纤维来进行分析得到纤维直径平均值和标准偏差。

1.4.2 力学性能测试

将纤维膜切割成70 mm×25 mm的样品。使用质构仪上的拉伸探针测量静电纺丝纤维的拉伸强度。试验参数如下：试验长度为 40 mm；拉伸速率为 5 mm/min；拉伸距离70 mm；试验温度为室温。根据这些试验，分别用公式1和2[19]计算了静电纺纤维的拉伸强度（σt）和断裂伸长率（εt）值。实验重复3次以获得平均值。

其中，σt是拉伸强度（MPa），p是断裂时的拉伸力（N），b是样品宽度（mm），d是样品厚度（mm）。

其中，εt是断裂伸长率（%），L0是样品的原始长度（mm），L是断裂处的长度（mm）。

1.4.3 化学结构分析

分别将纤维膜和Pis-1 PG粉末在白炽灯下干燥后切成碎片与溴化钾混合压入压片机成片，使用傅立叶变换红外光谱仪在波数范围 400～4000 cm-1对样品片进行了分析。

1.4.4 X射线衍射（XRD）分析

取适量纤维膜和Pis-1 PG粉末用XRD在工作电压和电流为40 kV和40 mA时，使用Cu Kα辐射，扫描速度设定为 16 °/min，并在 2θ范围为 5～90 °内测量测定电纺纤维的结晶性能。

1.5 Pis-1 PG/PLA纤维体外抗菌活性评价

以腐败希瓦氏菌为实验菌株，对所合成的 Pis-1 PG/PLA进行抗菌活性测定。将腐败希瓦氏菌培养稀释至106cfu/mL进行分析。使用前，将纤维的两侧暴露在紫外线下15 min，以消除表面细菌。然后，分别将1.00 mg的PLA纤维膜和Pis-1 PG/PLA的纤维膜加入2 mL接种细菌的培养基中，在28 ℃下的恒温震荡器中进行培养。样品每隔2 h吸取200 µL培养液添加到无菌96孔板中在595 nm处测量OD值并加入200µL无菌培养液以保持总体积恒定，以无纤维浸泡的细菌培养为对照组进行实验。每个样品进行3次平行实验并取平均值。

1.6 海鲈鱼的处理与分组

取新鲜海鲈鱼腹部鱼肉去皮，用无菌去离子水冲洗海鲈鱼鱼体表面，洗去黏液和部分微生物，在超净工作台中将鱼肉切割分成三组。第一组鲈鱼片用紫外线消毒（15 min）的Pis-1 PG/PLA电纺纳米纤维膜包裹。第二组鲈鱼片用紫外线消毒（15 min）的PLA电纺纳米纤维膜包裹。第三组无纺丝膜鲈鱼片（空白组）。将三组鱼片按每块样品60.00 g放入无菌蒸煮袋中，置于4 ℃冰箱冷藏备用。

1.7 菌落总数的测定

参照GB 4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数测定》[20]，对实验方法略有修改。将鱼肉置于超净工作台上，取5.00 g鱼肉样品置于已灭菌的蒸煮袋中，加入45 mL浓度为0.85%的无菌生理盐水，拍打均质120 s。将均质液进行10倍系列稀释。适当选择2～3个稀释倍数的稀释液，分别吸取1 mL加入至已灭菌培养皿中，再加入约20 mL已灭菌的平板计数琼脂培养基，摇匀，每个稀释度做3个平行。带琼脂凝固后，将平板翻转。置于28 ℃培养箱中培养48 h，最后进行菌落计数。

1.8 pH的测定

pH参照GB 5009.237-2016《食品pH值的测定》[21]的方法，称取5.00 g鱼肉样品，绞碎混匀置于锥形瓶中，无菌去离子水定容到45 mL均质静置半小时用PH计测定溶液PH，每组样品平行实验3次并取平均值。

1.9 TVB-N含量的测定

参照国标GB 5009.228-2016《食品中挥发性盐基氮的测定》[22]自动凯氏定氮仪法，将5.00 g搅碎的鱼肉样品于整流管中，依次加入25 mL去离子水和0.50 g氧化镁粉末，采用全自动凯氏定氮仪测定鱼肉样品的TVB-N含量，每组样品平行实验3次并取平均值。

1.10 数据处理

每个样品设置3个平行，采用Origin 8.5软件处理分析数据，采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，p＜0.05为差异性显著，p＞0.05为差异性不显著。

2 结果与讨论

2.1 静电纺丝纤维特性

2.1.1 纤维形态分析

图1 PLA和Pis-1 PG/PLA的纳米纤维SEM图像和直径分布直方图Fig.1 SEM image and diameter distribution histogram of PLA and PLA /Pis-1 PG nanofibers

PLA和Pis-1 PG/PLA纳米纤维膜表面光滑均匀，纤维膜容易与铝箔纸分离。图1显示了PLA和Pis-1 PG/PLA纳米纤维SEM图像。采用静电纺丝技术制备出的纤维的方向随机，形成网络结构，光滑无珠。PLA纤维直径为 170～430 nm，平均直径 255 nm。Pis-1 PG/PLA纤维的直径略有减小为160～400 nm，平均直径225 nm。这种现象可能是由于加入Pis-1 PG后，PLA溶液的导电性增加，导致纤维直径减小[23,24]。

2.1.2 力学性能

对PLA和Pis-1 PG/PLA纤维膜进行力学性能测试，如表1计算了纤维的拉伸强度（σt）和断裂伸长率（εt）。实验中静电纺丝纤维随着拉伸力的增大而伸长变形，拉伸力增大到一定程度后纤维断裂。实验数据表明 PLA纤维膜具有良好的拉伸强度和断裂伸长率，这一结论和Ding Ting等[19]制得的聚乳酸静电纺丝纤维膜所测出的力学性能结果类似。Pis-1 PG/PLA纤维膜的拉伸强度显著高于PLA纤维膜（p＜0.05），断裂伸长率差异不显著（p＞0.05）。这说明 Pis-1 PG/PLA纤维膜拉伸强度好，不容易断裂，适合用做食品保鲜膜。

表1 纤维膜力学性能Table 1 Mechanical Properties of fiber membrane

2.1.3 纤维结构分析

图2 PLA和Pis-1 PG/PLA纤维膜的FTIR光谱图Fig.2 FT-IR spectra of PLA and PLA / Pis-1 PG fiber membranes

图2为PLA纤维膜、Pis-1 PG/PLA纤维膜和Pis-1 PG粉末的FT-IR光谱图。在PLA纤维的红外光谱中PLA的特征吸收峰为1760.4 cm-1（-C=O伸缩振动），1184.1 cm-1（-C-O-伸缩振动），1092.0 cm-1（-C-O-伸缩振动）。上述峰在Pis-1 PG/PLA纤维中未消失且无较大的偏移。Pis-1 PG的特征峰为1136 cm-1（-C-O-伸缩振动），1546和1658 cm-1（-C=O伸缩振动），2852 cm-1（-C-H伸缩振动），3284 cm-1（N-H，O-H伸缩振动）。由于Pis-1 PG部分官能团与PLA相同，谱峰相近，在纤维膜的红外谱图中两种分子的谱峰出现叠加。在Pis-1 PG/PLA膜的中，Pis-1 PG含量低肽的强度明显减弱。实验表明Pis-1 PG的加入对PLA的结构无影响，肽与PLA主要为物理结合。这与杜智等[11]，将杆菌肽加入到聚乳酸静电纺丝纤维中的FT-IR光谱结果相同，肽的加入对PLA纤维膜的FT-IR光谱没有明显变化。

2.1.4 XRD分析

图3显示了Pis-1 PG/PLA纤维膜，PLA纤维膜和Pis-1 PG粉末的X射线衍射图。PLA纤维膜的主要衍射峰出现在2θ=20和22.9 °这是PLA晶体特有的衍射峰。Pis-1 PG粉末的宽衍射峰出现在2θ=21 °，这表明Pis-1 PG是微晶体结构。Pis-1 PG/PLA纤维膜的衍射峰出现在2θ=19.4和22.3 °和PLA纤维膜的衍射峰相比峰的锐度有所下降且峰宽度变大。Pis-1 PG/PLA纤维膜的衍射峰发生了小幅移动，这可能是由于静电丝纺过程中施加的电压更高电场发生变化引起的。PLA纤维膜负载 Pis-1 PG后衍射峰位置没有发生大的变化，表明添加Pis-1 PG不会改变PLA的结晶性质。然而衍射峰的锐度降低宽度变大，可能是由于Pis-1 PG是微晶体结构导致负载Pis-1 PG后PLA纤维膜结晶度降低。

图3 PLA和Pis-1 PG/PLA纤维膜的X射线衍射图Fig.3 X-ray diffraction patterns of PLA and PLA / pis-1 PG fiber membranes

2.2 体外抗菌活性

细菌悬浮液的浓度与吸光度值成正比，因此细菌生长可以通过细菌悬浮液吸光度曲线的趋势来判断[25]。图4显示了腐败希瓦氏菌菌悬浮液吸光度曲线，Pis-1 PG纤维膜组吸光度曲线显著低于对照组（p＜0.05）。Pis-1 PG/PLA纤维膜浸泡在腐败希瓦氏菌培养液中细菌在 0～6 h的生长速度被迅速抑制；在6～12 h细菌悬浮液的吸光度不断降低，细菌整体数量不断减少。Pis-1 PG纤维膜对腐败希瓦氏菌有持续抑菌的效果。PLA纤维膜组会使细菌悬浮液吸光度降低是由于 PLA有一定抑菌作用[26,27]但对细菌生长没有明显影响，和对照组差异不显著（p＞0.05）。实验表明Pis-1 PG纤维膜可以抑制海鲈鱼内优势腐败菌（腐败希瓦氏菌）[15]的生长，为Pis-1 PG/PLA纤维膜包裹海鲈鱼鱼肉实验提供依据。

图4 PLA和Pis-1 PG/PLA纤维膜对腐败希瓦氏菌生长的影响Fig.4 Effect of PLA and PLA / pis-1 PG fiber membranes on the growth of Shewanella putrefaciens

2.3 海鲈鱼冷藏期间菌落总数的变化

图5 海鲈鱼冷藏期间菌落总数的变化Fig.5 Changes of total colonies number of Sea bass during cold storage

菌落总数变化能直接反映鱼肉因微生物的作用而发生腐败的程度[28]。由图5可知，随着时间的延长各组海鲈鱼肉细菌总数均呈上升趋势，空白组的菌落总数上升最快在3 d达到了4.74 lg(cfu/mL)，超过一级鲜度4 lg(cfu/mL)；在6 d为6.98 lg(cfu/mL)，超过二级鲜度6 lg(cfu/mL)，显著高于Pis-1 PG/PLA纤维膜组（p＜0.05）。PLA 有一定抑菌作用[26,27]PLA 纤维膜组菌落总数低于空白组，但无显著性差异（p＞0.05）。PLA纤维膜组在3 d和6 d的菌落总数分别为4.60 lg(cfu/mL)和6.67 lg(cfu/mL)，并没有延缓鱼肉的腐败。整个冷藏期间Pis-1 PG/PLA纤维膜组菌落总数增长速度最缓慢。冷藏时间为6 d的Pis-1 PG/PLA纤维膜组菌落总数为4.96 lg(cfu/mL)，超过一级鲜度；在9 d菌落总数为5.84 lg(cfu/mL)接近二级鲜度，12 d时为7.27 lg(cfu/mL)，超过二级鲜度。整个冷藏期间 Pis-1 PG/PLA纤维膜组对鱼肉内微生物有持续的抑制作用，可能是由于PLA纤维膜有缓释作用[29]，Pis-1 PG可以从PLA纤维膜内持续释放出来，能长时间抑制鱼肉内微生物生长。实验表明Pis-1 PG/PLA纤维膜能阻止微生物细菌的生长对鱼肉中微生物的繁殖具有抑制效果，可以延缓鱼肉腐败3 d以上。

2.4 海鲈鱼冷藏期间pH的变化

图6 海鲈鱼冷藏期间pH的变化Fig.6 pH change of Sea bass during cold storage

由图6可知，海鲈鱼冷藏期间pH值都先下降后升高，与相关鱼肉冷藏期间pH变化趋势一致[30]。冷藏初期由于鱼肉内部体内糖原在无氧条件和酶的作用下分解形成乳酸及其他酸类物质，微生物无氧呼吸生成CO2产生酸类物质，从而导致pH值下降。冷藏时间6 d后由于细菌的繁殖及鱼肉蛋白质分解生成挥发性盐基氮等碱性物质导致pH值升高，对照组pH值为显著高于Pis-1 PG/PLA纤维膜组（p＜0.05）。冷藏时间为9 d时空白组pH值为6.22和PLA纤维膜组pH值为6.20，pH上升趋势明显，Pis-1 PG/PLA纤维膜组pH上升最为缓慢并在后期趋于稳定，15 d时pH值为6.20显著低于前两组（p＜0.05）。这与张海燕等[31]研究结果类似，在4 ℃的海鲈鱼片在6 d后pH值开始增加，且随着时间延长处理组pH值上升速度低于对照组。由此说明，Pis-1 PG/PLA纤维膜能够有效抑制鱼肉内微生物的生长，减缓碱性物质的产生和积累，从而控制pH值上升，起到保鲜效果。

2.5 海鲈鱼冷藏期间TVB-N值变化

TVB-N是判断鱼肉腐败程度的重要指标，反映了鱼肉蛋白质被内源酶和微生物的作用分解产生具有挥发性胺类物质的情况[32]。由图7可知，随着冷藏时间增加各组鱼肉内 TVB-N含量逐渐增大。冷藏前期，鱼肉内的蛋白酶分解蛋白质产生胺类物质，各组样品TVB-N值增长缓慢。冷藏6 d后，鱼肉内腐败希瓦氏菌等优势腐败菌大量繁殖，产生大量氨、二甲胺和三甲胺等胺类物质，使菌落总数和pH值在此时快速上升，导致TVB-N值快速上升。空白组TVB-N值上升最快，冷藏6 d时显著高于Pis-1 PG/PLA纤维膜组（p＜0.05），在冷藏期间为9 d时超过一级新鲜度（15 mg/100 g），12 d时超过二级新鲜度（20 mg/100 g）。PLA纤维膜组冷藏期间为12 d时TVB-N值为19.41 mg/100 g超过一级新鲜度接近二级新鲜度。Pis-1 PG/PLA纤维膜组 TVB-N值上升趋势最慢冷藏期间12 d时为15.25 mg/100 g超过一级新鲜度，15 d时为21.85 mg/100 g超过二级新鲜度。由此说明，Pis-1 PG/PLA纤维膜抑制腐败希瓦氏菌等产胺类的腐败菌生长，延缓胺类物质的积累，从而减缓 TVB-N值增长。

图7 海鲈鱼冷藏期间TVB-N值变化Fig.7 Changes of TVB-N in Sea bass during cold storage

3 结论

本研究通过静电纺丝技术成功地制备了 Pis-1 PG/PLA纳米纤维膜。SEM结果表明纳米纤维呈线状，结构光滑无序；Pis-1 PG加入后，纤维膜平均纤维直径下降至225 nm。Pis-1 PG的加入使得Pis-1 PG/PLA纤维膜拉伸强度提升至2.70 MPa，结晶度降低，PLA的结构没有发生变化。Pis-1 PG/PLA纤维膜在6 h内会抑制腐败希瓦氏菌的生长并有持续抑菌的效果，Pis-1 PG/PLA纤维膜对腐败希瓦氏菌有明显的抗菌活性。用Pis-1 PG/PLA纤维膜包裹处理海鲈鱼鱼肉后，纤维膜会抑制鱼肉中微生物的生长。在4 ℃贮藏6 d后，Pis-1 PG/PLA纤维膜处理鱼肉的菌落总数低于空白组2.02～3.23 lg(cfu/mL)，进而有效抑制鱼体pH值和TVB-N含量的升高，能够延长海鲈鱼鱼肉冷藏期3 d以上，对海鲈鱼有保鲜效果。综上所述，Pis-1 PG/PLA纤维膜可应用于鱼肉保鲜中，在食品包装方面具有应用潜力。