南五味子酯甲提取及复配保鲜液应用研究

吕 晨，张晓虎，张艳娜

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

0 引言

南五味子即木兰科植物华中五味子(SchisandrasphenantheraRehd et Wils)，是一种益气安神、敛肺生津的药食两用中药材[1]。研究发现五味子中的木脂素、多酚、挥发油、多糖、黄酮等多种活性物质均具有抑菌抗氧化及保鲜作用[2～7]。木脂素类化合物作为南五味子功效成分之一，已鉴定分离出五味子甲素、五味子酯甲、五味子醇甲、五味子乙素、五味子醇乙等150多种单体物质，具有保肝护肝、延缓骨质疏松、改善记忆力、降血脂等药理作用[8～10]。

已有文献表明木脂素具有抑菌保鲜作用[11]，而作为木脂素单体化合物之一的五味子酯甲，具有抗疲劳[12]、抗氧化[13]等作用，却少有抑菌及保鲜作用研究报道。因此，笔者拟对商洛南五味子酯甲的提取、抑菌及复配保鲜液在番茄保鲜应用予以研究，以期为南五味子酯甲抑菌及应用于果蔬保鲜提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 主要有:

材料：南五味子果实(2019年8月购于商洛市商州区福鑫康药业)；当日产新鲜番茄(购于商洛市商州区蔬菜市场)。

试剂：无水乙醇(分析纯)、甲醇(色谱纯)、生理盐水、五味子酯甲标准品(购于江苏永健医药科技有限公司)、蒸馏水、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、壳聚糖、植酸、氯化钙。

菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌(购于北京华工科创生物技术有限公司)。

1.1.2 主要仪器 SI-234型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；SHP-80型生化培养箱，上海培因实验仪器有限公司；FW-135型中草药粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；LC-20A型高效液相色谱仪器，岛津(中国)有限公司；DHG9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 南五味子酯甲提取与测定 主要有:

(1)材料预处理。南五味子果实经60℃恒温干燥4h至恒重后用中草药粉碎机粉碎过60目筛，置于干燥广口瓶备用。

(2)五味子酯甲标准曲线制备。色谱条件：WondaSil-C18分析柱(250 mm×4.6 mm)、柱温40℃、流动相：甲醇和水(75∶25)、波长254 nm、进样量10μL、流速1.0 mL·min-1。

制备标准曲线：用甲醇溶解精密称取的10.0 mg五味子酯甲标品于10 mL容量瓶定容并摇匀，得到1.0 mg·mL-1的标准品储备液备用。精密吸取五味子酯甲储备液并用甲醇将其配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg·mL-1等5个浓度梯度的标准溶液，以甲醇为空白，采用高效液相色谱法制备五味子酯甲标准曲线[14]。以五味子酯甲标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线如图1，回归方程为：Y = 117101X - 763.53，R2= 0.9997。

图1 五味子酯甲标准曲线

(3)南五味子酯甲提取及测定。称取0.5 g南五味子果实粉末于100 mL具塞管，在250 W、40 kHz超声条件下，用不同乙醇浓度、液料比、超声提取时间和超声温度提取完成后抽滤，所得滤液用0.45 μm微孔滤膜滤过即得南五味子酯甲供试品溶液，在上述色谱条件下进样10 μL，检测色谱峰面积后计算提取率[15]。

(4)单因素实验。分别考察乙醇浓度(55%、65%、75%、85%、95%)、液料比(60、80、100、120、140 mL·g-1)、超声提取时间(20、30、40、50、60 min)及超声温度(35、45、55、65、75℃)4个因素对南五味子酯甲提取率的影响。

(5)响应面实验设计。在单因素实验结果基础上，以南五味子酯甲提取率为考察目标，利用Design Expert8.0.6软件对提取率影响较显著因素进行3因素3水平响应面设计实验，得出最佳优化提取工艺参数，并进行验证实验测评最佳提取工艺参数可靠性[16]。

1.2.2 抑菌性实验 主要有:

(1)菌悬液的制备。将活化后的菌株用生理盐水配制成1×108CFU·mL-1菌悬液，振荡混匀备用。

(2)抑菌能力测试。采用滤纸扩散法测定不同浓度南五味子酯甲对三种常见致病菌的抑菌能力，通过抑菌圈直径判定抑菌能力强弱。将直径6 mm滤纸片干热(121℃，30 min)灭菌后冷却备用。制备5个浓度梯度的南五味子酯甲(5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg·mL-1)溶液，将2mL菌悬液均匀涂布于平面固体培养基，并将备用滤纸片浸渍于不同浓度南五味子酯甲溶液中，用镊子夹起1 min后轻贴于培养基表面，以浸渍无菌水的纸片为空白，于37℃恒温培养箱中12～48 h后观察，用十字交叉法测量抑菌圈直径，3次平行试验后取平均值[17,18]。

1.2.3 南五味子酯甲对番茄保鲜效果试验 不同含量南五味子酯甲与壳聚糖、植酸、氯化钙复配成表1配方进行番茄保鲜实验[19～21]。

表1 不同含量配方 (%)

选取市售无虫害损坏、果型完整饱满、大小均匀的当日产新鲜番茄，用蒸馏水清洗果皮表面污物杂质后分4组，浸泡在不同配方保鲜液中10 min后取出晾干，蒸馏水清洗组为空白对照，用保鲜膜密封(15℃、RH65%)存放，每3 d测定相关指标[22]，3次平行实验取平均值。相关考察指标如下：

失重率(%)=(初始质量-当前质量)/初始质量×100%

可溶性固形物含量：手持糖量计法[22]。

VC含量：2,6-二氯靛酚法[23]。

2 结果与分析

2.1 南五味子酯甲提取结果分析

2.1.1 单因素实验结果与分析 由图2～图5可知，4个单因素对南五味子酯甲提取率的影响皆呈先上升后降低的趋势，在乙醇浓度75%、液料比100 mL·g-1、超声温度55℃、超声提取时间50 min时提取率最高，且乙醇浓度、液料比、超声温度的影响较显著。

图2 乙醇浓度对南五味子酯甲提取率影响

图3 液料比对南五味子酯甲提取率影响

图4 超声温度对南五味子酯甲提取率影响

图5 超声提取时间对南五味子酯甲提取率影响

2.1.2 响应面实验结果与分析 主要有:

(1)响应面实验方案及数据分析。响应面实验方案与结果见表2。

用软件分析数据进行多元回归拟合分析所得方程如下：

Y=0.24+0.011A+0.023B+0.014C+0.0065AB+0.00625AC+0.014BC-0.032A2-0.048B2-0.051C2

回归模型方差分析见表3。

表2 响应面实验方案与结果

表3 回归模型方差分析

表3中相关系数R2、校正系数Adj R2及变异系数C.V.%可反应回归方程的可信度。其中Adj R2=0.9986，表明该回归模型可以解释99.86%的响应值变化；变异系数C.V.%=0.97%，说明该实验所得数据具有较高稳定性。因此，可通过该方程优化南五味子果实中五味子酯甲提取工艺。

回归模型系数显著性检验结果见表4。

表4 回归模型系数的显著性检验结果

表4可知，实验所得回归模型系数具有高度显著性。表中一次项A、B、C、二次项A2、B2、C2及交互项BC的P值均小于0.0001，说明其对南五味子酯甲提取率的影响极显著，而交互项AB、AC的P值皆小于0.05，表明其交互作用对南五味子酯甲提取率的影响显著。由于模型P失拟项=0.8395 > 0.05，不显著，表明拟合的回归方程符合实际情况，能较好地反映真实的实验值。因此，该模型可用于对南五味子酯甲提取率的分析和预测。

(2)响应面分析。图6中，乙醇浓度与液料比之间交互作用影响显著。当乙醇浓度一定，液料比达到100 mL·g-1时提取率最大；当液料比一定，乙醇浓度为74%～76%时提取率最大。

图7中，乙醇浓度与超声温度之间交互作用影响显著。当乙醇浓度一定，超声温度为54～56℃时提取率达到最大；当超声温度一定，乙醇浓度为74%～76%时，提取率达到最大。

(a)等高线 (b)响应曲面

(a)等高线 (b)响应曲面图7 乙醇浓度和超声温度对南五味子酯甲提取率的影响

(a)等高线 (b)响应曲面图8 液料比和超声温度对南五味子酯甲提取率的影响

图8中，超声温度与液料比之间交互作用影响显著。当液料比一定，液料比达到54～56℃时提取率达到最大；当超声温度一定，当液料比为100 mL·g-1时，提取率达到最大。

综上分析及模型预测得出在乙醇浓度76.07%、液料比102.62 mL·g-1、超声温度56.05℃的最佳提取工艺条件下，南五味子酯甲提取率的预测值为0.263%，为便于试验操作，将最终条件确定为乙醇浓度75%、液料比100 mL·g-1、超声温度55℃，在此条件下进行三次平行试验得出提取率为0.273%，与预测值相差3.8%。

2.2 抑菌实验结果分析

南五味子酯甲抑菌效果见表5。

表5 南五味子酯甲抑菌效果

由表5可知，南五味子酯甲对三种致病菌皆有抑菌效果，且抑菌效果随着浓度的增大而增强，其抑菌效果顺序为：枯草芽孢杆菌>大肠杆菌>沙门氏菌。

2.3 番茄保鲜实验结果与分析

2.3.1 失重率变化趋势分析 由图9可知，对照组和实验组番茄失重率随储藏天数延长都呈不断增大的趋势，且在第9天后失重率出现明显增加，表明番茄在储存期间会因失水及营养成分流失出现减重现象，且时间越长减重程度越大。空白处理的对照组失重率变化最大，在第9～15天时变化最明显，第15d时达到了3.17%，实验组失重率出现缓慢增大的过程，其中T3组配方对番茄失重率的延缓效果最佳，到第15天时其失重率只有0.84%。

图9 失重率变化趋势

2.3.2 可溶性固形物变化趋势分析 由图10可知，对照组和实验组中番茄可溶性固形物含量随储藏天数延长呈先减少后增大的趋势，其转折趋势与番茄后熟导致可溶性糖、酸等营养成分含量增加有关。空白处理的对照组可溶性固形物含量变化最大，在第12～15天时变化最明显，实验组在储藏后期可溶性固形物含量都低于初始含量，其中T3组配方抑制含量增加的能力最佳，到第15d时其含量只有6.98%。

图10 可溶性固形物变化趋势

2.3.3 VC含量变化趋势分析 由图11可知，对照组和实验组中番茄Vc含量随储藏天数延长呈下降趋势，表明Vc在储存期间会因易光解、易氧化等性质出现分解和流失，从而导致其含量下降。空白处理的对照组番茄Vc含量变化最大，实验组Vc含量都呈缓慢下降趋势，这在一定程度上表明三组配方都能有效减少Vc流失，T3组配方对Vc含量减少的延缓效果最佳，15 d时其含量为14.64 mg·100g-1。

图11 VC含量变化趋势

综上得知番茄储藏时间随着配方中南五味子酯甲含量的增加而延长了6～9d，反映其保鲜效果的3个参考指标中失重率和Vc含量下降趋势变缓，可溶性固形物含量增加趋势变缓，且三组配方中南五味子酯甲2%、壳聚糖2%、植酸0.1%、氯化钙0.5%含量的复配保鲜液保鲜效果最好。

3 结论与讨论

3.1 结论

(1)乙醇浓度、液料比、超声温度3个单因素对提取率有较显著的影响，而超声提取时间的影响较小；在液料比100 mL·g-1、超声温度55℃、乙醇浓度75%浸提50 min的最优提取条件下，南五味子酯甲提取率为0.263%。

(2)抑菌效果：枯草芽孢杆菌>大肠杆菌>沙门氏菌；抑菌效果随着南五味子酯甲浓度的增大而增强，25.00 mg·mL-1溶液对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为18.3 mm。

(3)不同含量南五味子酯甲复配保鲜液处理番茄，其储藏时间延长了6～9 d，南五味子酯甲2%、壳聚糖2%、植酸0.1%、氯化钙0.5%含量的复配保鲜液在加速储藏期间对番茄失重率等相关指标的变化具有明显抑制作用。

3.2 讨论

(1)研究采用超声辅助乙醇浸提南五味子酯甲，具有耗能低、可操作性强、能重复回收溶剂、节约成本等优势，适用于工业化大批量生产。实验所得南五味子酯甲提取率略低于祁星星的实验得率[14]，其原因一是不同产地南五味子果实中南五味子酯甲含量存在差异；二是南五味子酯甲在乙醇中溶解度低于甲醇，致使提取率降低；三是提取实验升温造成乙醇挥发，使得乙醇浓度降低影响提取率。

(2)南五味子酯甲提取液对革兰氏阳性菌的抑菌效果强于革兰氏阴性菌，此实验结果为南五味子木脂素单体成分对常见食品腐败菌的抑菌作用提供了理论依据，但还有必要深入探讨其抑制机理和量效关系。

(3)番茄保鲜实验验证了南五味子酯甲在与壳聚糖、植酸、氯化钙复配制成保鲜液后，具有延长常见易腐败果蔬储存时间的作用，能够作为生产实践中将南五味子酯甲用于果蔬类贮藏保鲜的技术参考。