机械搅拌式生物反应器悬浮培养293T细胞生产慢病毒的工艺

唐取来，顾力行，周勇，吴寒，祝海川，顾潮江，周经娇，罗学刚，张同存,

(1.天津科技大学生物工程学院，天津市工业微生物重点实验室，天津 300457；2.武汉科技大学生命科学与健康学院，湖北 武汉 430065)

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-Cell,CAR-T)是通过基因改造技术，让T细胞表达嵌合抗原受体，使效应T细胞的靶向性、杀伤性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，同时可以克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态。慢病毒载体是CAR-T基因治疗的重要载体，相比一般的逆转录病毒载体具有更高的安全性和高效性[1]。近年来，慢病毒载体已被广泛应用于传染性疾病、基因功能及恶性肿瘤的基因治疗领域[2-3]。探索药品生产质量管理规范(good manufacturing practice,GMP )级别规模化和可重复的慢病毒生产工艺，是临床试验和商业生产的迫切需求[4]。293T细胞是由293细胞派生出来的表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系。作为最常用的慢病毒包装细胞系，293T采用传统单层贴壁血清培养方式[5]。但是，血清贴壁培养存在成分复杂、含有动物成分且批次差异等问题[6]，同时贴壁培养过程中胰酶的使用会增加细胞脆性，导致细胞膜破裂。孙克宁等[7]研究表明胰酶的使用会降低慢病毒生产效率。相比较之下，无血清悬浮培养无动物来源的组分，减少了产物外源物质污染的风险，简化了下游纯化工艺，大大推进了其向临床级别产品的转变，且重复性好，生产效率高，可大规模高密度悬浮细胞培养，是哺乳动物细胞培养技术的发展方向[6]。目前，工业上使用悬浮细胞系替代贴壁细胞进行生产已经成为趋势，如MDCK细胞、BHK21细胞[8]以及CHO细胞等[9]。

机械搅拌式生物反应器是比较常见的生物反应器，具有重复灭菌操作、低成本的优势，多用于微生物和动物细胞培养，根据动物细胞特点，其操作与微生物发酵罐相似，简单易行[10]。近年来，机械搅拌式生物反应器逐渐应用于生物制药行业[11-12]。搅拌式动物细胞反应器整套系统可智能远程控制搅拌速度、温度、pH值和溶氧值[13]等因素。王妍等[14]通过机械搅拌式生物反应器对CHO细胞进行了40 d的培养，得到重组人干扰素。冯二凯等[15]同样采用搅拌生物反应器对Vero细胞进行培养，得到水貂犬瘟热活疫苗。然而，机械搅拌式生物反应器细胞培养十分依赖于微载体，在增加成本的同时增加了下游检测项目，且罕见有用于293T细胞生产慢病毒载体的研究。

机械搅拌式生物反应器L型导管大泡通气系统可以将大泡经过搅拌变成细小的气泡，使得混合气体分散完全，但相比微泡通气系统存在较高的剪切力和较差的溶氧效果。293T细胞作为贴壁细胞对培养条件极为敏感，因此在不添加微载体前提下用大泡通气系统搅拌式动物细胞反应器对悬浮293T细胞进行培养和慢病毒包装具有一定的挑战[16]。本研究采用驯化的293T悬浮细胞在15 L三叶轮机械搅拌式生物反应器中高密度培养，初步建立了高效、低成本的L型大泡通气系统机械搅拌式生物反应器293T悬浮细胞慢病毒生产工艺，为慢病毒扩大规模生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞和质粒

贴壁 293T细胞购买于美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection，ATCC)。慢病毒包装体系及研究平台由武汉波睿达生物科技有限公司提供。

1.2 培养基和补料

原培养基：体积分数90%DMEM培养基(Gibco公司)和体积分数10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Gibco公司)；新培养基：体积分数50%293 CD05 Medium无血清基础培养基(上海奥浦迈生物科技有限公司)和体积分数50%SMM293-TⅡ培养基(北京义翘神州生物有限公司)。补料培养基为CHO PFF06培养基(上海奥浦迈生物科技有限公司)。

1.3 贴壁细胞驯化

参照井莲娜等[17]方法并略有改动。293T贴壁细胞，采用体积分数0.25%胰酶消化后，细胞活率大于90%按照如下操作。适应驯化的指标细胞活率大于等于90%，且所有细胞3 d完成1次传代。如表1所示。

表1 293T悬浮细胞驯化的方案Table 1 Protocol of acclimation 293 T suspension cells

方法1：原培养基替换成体积分数100%新培养基，以6×105个·mL-1细胞密度接种至工作体积为20 mL的125 mL摇瓶。摇床(sk-r1807-S，美国赛洛捷克公司)培养条件为130 r·min-1，体积分数5% CO2，37 ℃。

方法2：原培养基替换成体积分数100%新培养基，以4×105个·mL-1细胞密度接种至10 mL的T75方瓶静置。培养条件为体积分数5%CO2，37 ℃。

方法3：原培养基替换为体积分数75%原有培养基和体积分数25%新培养基，以4×105个·mL-1细胞密度方瓶静置培养。

方法4：原培养基替换为体积分数75%原培养基和体积分数25%新培养基，以6×105个·mL-1细胞密度摇瓶静置培养。

1.4 慢病毒包装

靶向CD30蛋白表达质粒(CAR)及包装质粒(GAG，VSVG，REV) 4株DH5α，振荡培养过夜后用大提试剂盒提取质粒。四质粒包装系统利用PEI转染细胞。293T贴壁细胞以1.4×108细胞总数接种至细胞工厂(Conning公司)，并且生长汇合至 50%～70%进行转染，不进行补液，72 h收获上清液；293T悬浮细胞在摇瓶和生物反应器培养，培养2 d后流加质粒复合物和补料培养基，48 h收获发酵液的上清液。

1.5 种子复苏扩培

驯化后野生型293T悬浮细胞从液氮中取出快速复苏，37 ℃，置于摇床培养，转速为130 r·min-1。经传代逐步放大培养后，接种至机械搅拌式生物反应器。293T贴壁细胞从液氮中取出快速复苏，37 ℃，置于培养箱培养。经传代逐步放大培养后，接种至细胞工厂。

1.6 机械搅拌式生物反应器培养

采用15 L三叶轮L型大泡通风系统搅拌型Applikon生物反应器(荷兰，Z4AEZ0015M)，工作体积为5.5 L。以细胞密度3.5×105～5.0×105个·mL-1接种，添加体积分数0.1%细胞保护剂(Pluronic®F-68，sigma)溶液后，CO2调节 pH值 7.0～7.2。通过L型大泡通气系统通入O2/CO2/空气的混合气体将溶氧(dissolved oxygen，DO)控制在 40%～70%，全程转速130 r·min-1，温度37 ℃，12 h取样，记录细胞密度及细胞活率。细胞密度达1.5×106个·mL-1进行慢病毒包装，24 h流加补料，48 h后收获培养液。

1.7 检测方法

细胞计数和活率检测[18]：采用血球计数板点样计算细胞密度，台盼蓝拒染法计算细胞活率，计数3次取平均值。

慢病毒包装效率检测[19]:将293T贴壁细胞以5×105个·mL-1接种于贴壁6孔板，然后加入3 000×g高速离心25 min(Microfuge 20R，Beckman公司)后的培养液上清和4 mg·L-1polybrene混合物进行培养。3 d后流式测定慢病毒活性滴度。贴壁感染后293T细胞用versene(Gibco公司)消化，用体积分数2%FBS(Gibco公司)的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)(Gibco公司)终止消化后300×g离心5 min，山羊抗兔IgG二抗 (HRP)(北京义翘神州科技有限公司)抗体4 ℃避光染色0.5 h，染色后的细胞用PBS，300×g离心5 min。Anti-Mouse FMC63 scFv mAb(BioSwan)抗体与细胞按照V(抗体)∶V(细胞)=1∶50染色，4 ℃避光0.5 h，用PBS，300×g离心5 min，通过流式细胞仪(BD Biosciences公司)测CD30-CAR的阳性细胞(CD30-CAR+)比例，即CD30-CAR慢病毒的包装效率。通过流式细胞术检测293T细胞转染效率并计算活性滴度公式如下：

(1)

式中：q为病毒滴度，指可以感染并进入到细胞中的病毒基因组数，单位为TU·mL-1，即每mL病毒液中含有具有生物活性的病毒颗粒数；X为阳性细胞比例；N为病毒终体积，单位为μL。

1.8 统计学分析

应用V10版本Flowjo软件和8.0版本GraphPad软件进行图像处理和数据显著性分析。

2 结果与分析

2.1 贴壁293T细胞驯化结果

采用4种驯化方法，从贴壁293T细胞中驯化出野生型悬浮293T细胞。如图1-A所示，方法2和方法4在驯化第1代细胞活率低于30%，与驯化前细胞相比显著影响细胞活率(P<0.01)。方法3的细胞活率随培养代数的增加逐渐下降，在培养到第3代细胞活率低于30%，与驯化前细胞活率相比其影响显著(P<0.01)。采用方法1驯化的细胞，培养4代细胞活率均大于90%，与驯化前细胞活率相比没有显著差异(P>0.05)。试验采用直接替换培养基和培养器皿的方法1对贴壁293T细胞进行多次驯化，结果一致。复苏后的悬浮细胞在摇瓶连续培养14代，如图1-B所示细胞密度均大于3×106个·mL-1，且细胞活率均大于90%。试验证明贴壁细胞成功驯化为悬浮293T细胞。

注：A：不同驯化方法下各代293T细胞活率；B：连续培养14代的细胞生长密度和细胞活率曲线。NS：P>0.05，差异不显著；*：P<0.05，差异显著；**：P<0.01，差异极其显著。下同。Note：A to B：each passage of cell viable with different domestical method(A),the cell density and viable curve with 14 passages(B).NS:P>0.05,no significant difference;*:P<0.05,significant difference;**:P<0.01,highly significant difference .The same as below.图1 293T悬浮细胞驯化结果Fig.1 Result of acclimation of 293 T suspension cells

2.2 悬浮293T细胞慢病毒包装效率

悬浮细胞慢病毒包装效率用流式细胞术检测，试验结果如图 2所示。用 0、0.5、1.0、3.0、10.0、30.0 μL细胞培养病毒原液转染293T贴壁细胞，其CD30-CAR+细胞比例分别为0%、1.7%、4.0%、10.6%、28.5%和53.7%，通过公式(1)计算得出病毒原液的滴度为1.8×107TU·mL-1，该结果证明驯化后的悬浮293T细胞具有慢病毒包装能力。

注：图中比例为流式细胞术分析不同病毒添加体积感染293T贴壁细胞后CD30-CAR+细胞比例。Note：The ratio in figure means flow-based analysis of the ratio of CD30-CAR+ cells after 293T adherent cells were infected with different volume of virus.图2 摇瓶生产CD30-CAR慢病毒的转染效率Fig.2 Transfection efficiency of the CD30-CAR lentivirus production in shake flask

2.3 悬浮293T细胞种子扩增

按照1.5的方法，对悬浮293T细胞种子进行扩增，建立1条细胞种子扩增链。如表2所示，种子扩增链要求每代细胞活率大于90%，细胞密度大于3.0×106个·mL-1。经过二级种子扩增后，得到2.3×109个细胞能够满足5.5 L工作体积的生物反应器细胞培养和慢病毒包装。

表2 293T悬浮细胞摇床培养种子扩增链Table 2 Seed train process of 293 T suspension cells using shaking culture

2.4 机械搅拌式生物反应器悬浮培养293T细胞

驯化后的293T悬浮细胞以3.5×105～5.0×105个·mL-1的接种密度，与无血清基础培养基组成5.5 L的培养体系，在机械搅拌式生物反应器中进行培养。如图3所示，每12 h取样计算细胞活率和细胞密度并绘制细胞生长曲线。在5.5 d左右细胞密度随时间的增加而增加，且细胞活率均大于90%，与种子细胞活率相比没有显著差异(P>0.05)；在5.5 d后细胞密度和活率直线下降，6.5 d时细胞密度低于2×106个·mL-1,细胞活率低于30%(P<0.01)。试验证明经驯化的293T悬浮细胞以5.5 L的培养体系在机械搅拌式生物反应器中培养时间为5.5 d。

图3 生物反应器中293T悬浮细胞生长曲线和细胞活率Fig.3 Cell growth curve and viability of 293T suspension cells in the bioreactor

2.5 机械搅拌式生物反应器包装慢病毒

用 0、1、3、10、30、100 μL细胞培养病毒原液转染293T贴壁细胞流式细胞术检测结果如图 4-A所示，CD30-CAR+细胞比例分别为0%、13.7%、36.4%、65.7%、92.4%和95.1%，通过公式(1)计算得出病毒原液的滴度为 6.5×107TU·mL-1。

2.6 细胞工厂和反应器慢病毒包装效率的比较

用0、20、50、100、500和1 000 μL细胞工厂培养病毒原液转染293T贴壁细胞流式细胞术检测结果如图4-B所示，CD30-CAR+细胞比例为0%、8.7%、18.3%、37.0%、86.0%、94.1%，通过公式(1)计算得出病毒原液滴度为 1.9×106TU·mL-1。

注：流式细胞术分析机械搅拌式生物反应器(A)和细胞工厂(B)生产的不同体积病毒感染293T贴壁细胞后CD30-CAR+细胞比例。Note：Flow-based analysis of the ratio of CD30-CAR+ cells after 293T adherent cells were infected with different volume of virus produced in bioreactor(A) and cell factory(B).图4 生物反应器和细胞工厂生产CD30-CAR慢病毒的转染效率Fig.4 Transfection efficiency of the CD30-CAR lentivirus production in bioreactor and cell factory

细胞工厂和机械搅拌式生物反应器包装5.5 L慢病毒原液的比较如表3所示。生物反应器生产的慢病毒活性滴度为细胞工厂的34倍，其转染密度是细胞工厂的58倍，其细胞产毒率是细胞工厂的6倍；细胞工厂在耗材成本(培养基和培养器皿等一次性损耗品)是反应器的5倍。

表3 细胞工厂和机械搅拌式生物反应器生产5.5 L慢病毒原液的比较Table 3 Comparison of 5.5 L lentiviral stoste production in cell factory and bioreactor

3 结论与讨论

人类免疫缺陷病毒(HIV-1)来源的慢病毒载体作为基因递送工具在细胞治疗、遗传性疾病治疗中显示出广泛的用途。目前，以CAR-T 治疗方法为代表的血液肿瘤的细胞治疗药物已经走进了临床[20-21]。作为肿瘤的个体化精准治疗方法，CAR-T细胞的生产工艺影响到细胞的质量及治疗的效果，而CAR-T的生产工艺最核心在慢病毒的生产，其生产工艺的放大显得极为重要[22]。293T细胞悬浮状态下可直接用于病毒包装，节省了细胞消化时间，同时充分利用立体空间，实现高密度培养，解决了贴壁状态下生产空间需求大、人工成本高、产品批次质量不稳定以及在规模扩大上受限等问题[23]。孟其麟等[6]采用分步适应的方法40 d完成HEK293 细胞无血清培养基的适应。本研究实现了293T贴壁细胞在7 d左右被驯化成悬浮细胞，且在未添加固定载体和抗接团剂条件下完成大规模慢病毒包装，在摇瓶小规模试验中包装滴度是细胞工厂贴壁细胞的10倍。

本研究证明，驯化293T悬浮细胞在机械生物反应中能够高密度倍增生长，同时进行慢病毒包装生产的滴度高于摇瓶3.6倍、细胞工厂34倍，在成本和产毒效率上与细胞工厂工艺相比，均具有较强的竞争力。驯化293T悬浮细胞采用机械搅拌式生物反应器生产5.5 L的6.5×107TU·mL-1活性慢病毒，按照下游纯化20%～65%的回收率[24]，可以得到至少7.2×1010TU活性慢病毒。陈思毅等[25]发现1个患者需要最高剂量为2×108～3×108个CAR-T细胞。叶丽伟等[26]在成熟T淋巴细胞中重组慢病毒1～10感染复数。以T细胞10的感染复数计算，5.5 L大规模机械生物反应器生产一批慢病毒预计最低可供71人份，这将大大简化生产和质检的工作，降低生产CAR-T的成本，同时保证患者所需慢病毒来源于同一批次。本研究初步建立了利用大泡通气系统机械搅拌式生物反应器悬浮高密度培养293T细胞生产慢病毒的工艺，同时为慢病毒扩大规模生产奠定基础，对其他类型的293T悬浮培养产品的生产也具有参考意义。