高血糖对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及GRP 78表达的影响

卢俊江 胡泳涛 李艳 方毅敏 韩江全△

(1.广州市胸科医院结核内科，广东 广州 510000；2.遵义医学院第五附属(珠海)医院神经内科，广东 珠海 519100；3.广州市胸科医院医务科，广东 广州 510000)

脑梗死是神经系统常见病和多发病，其致残率高，严重影响患者生活质量，加重社会负担。大约有三分之一的脑梗死患者发病时血糖水平升高[1]，近年来，我国糖尿病发病率一直增加，在高血糖的情况下，脑缺血发展更快更严重，但高血糖加重脑缺血组织损伤的机制仍不明确。细胞凋亡已被公认其在高血糖加重脑缺血损伤过程中起重要作用[2]，既往对于细胞凋亡，主要聚焦于线粒体通路及死亡受体通路，新近研究则显示，内质网途径同样起着关键的作用。caspase-9、caspase-12是caspase家族的重要成员，是内质网通路导致凋亡的关键因子，在缺血缺氧、Ca2+平衡失调等各种刺激过长过强时，Caspase-12前体被大量激活，并从内质网转移至细胞胞浆，依次激活凋亡启动因子Caspase-9引发caspase蛋白水解级联效应，发生细胞凋亡。而葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)在应激情况下，则解除对未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)通路蛋白的抑制，而使内质网达到稳态。GRP78在应激条件下，一方面对细胞起保护作用，另一方面亦可作为内质网应激的敏感标记物。本实验通过研究高血糖对大鼠脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及GPR78表达的影响进一步探讨高血糖加重脑缺血损伤的机制。报告如下。

1 材料和方法

1.1实验动物及分组 健康雄性SD(SpragueDawley，SD)大鼠30只，8～9周龄，体质量250～300 g，由遵义医学院珠海校区中心实验室提供。随机分为3组：高血糖组、正常血糖组、假手术组，每组10只。

1.2实验方法

1.2.1高血糖大鼠模型的制备 大鼠实验前禁食12 h，自由进水。高血糖组于造模前30 min按体质量4 g/kg经尾静脉注射25%(质量浓度)葡萄糖，造成高血糖状态。正常血糖组和假手术组注射等量18%(质量浓度)D-甘露醇。于栓线前测定鼠尾血糖水平。

1.2.2局灶性脑缺血再灌注模型的制备 采用Longa线栓法[3 ]建立大脑中动脉阻塞缺血再灌注模型，均阻断右侧大脑中动脉。假手术组不阻断右侧大脑中动脉，余操作与其他组相同。

1.2.3神经功能评分 参照Zea-Longa 5分制评分标准[4]，于缺血2 h再灌注24 h对大鼠进行神经功能评分，2分或2分以上者为造模成功。

1.2.4细胞凋亡检测 取材视交叉后2 mm处平面组织进行切片，片厚5 um。TUNEL染色步骤按试剂盒说明书进行(武汉博士德公司产品)。阳性标准：光镜下观察细胞核呈棕黄色者为TUNEL染色阳性细胞。根据大鼠脑缺血半暗带的定位方法，将大脑中动脉阻塞的同侧额顶叶皮质上部界定为半暗带的等值观察区。高倍镜下(400倍)随机分别观察顶叶皮质缺血半暗区不重叠的5个视野，计算TUNEL阳性细胞平均数。

1.2.5免疫组化法检测细胞凋亡相关 caspase-12、caspase-9表达 组织切片经60℃的恒温箱烘120 min拷片后脱蜡；经二甲苯脱蜡，至无水酒精至95%酒精至85%酒精至70%酒精至蒸馏水洗涤湿化；再经3%H2O2室温孵育后pH6.0的0.01M枸橼酸盐缓冲液中微波修复抗原，pH7.4的PBS洗涤；5%BSA室温封闭，分别滴加兔抗caspase-12Rabbit mAb或caspase-9Rabbit mAb，4℃冰箱孵育过夜后，pH7.4的PBS洗涤；生物素化山羊抗兔IgG1 37℃孵育30 min后PBS洗涤；链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，37℃孵育及PBS洗涤；DAB显色，室温条件显微镜下显色；苏木素复染，1%盐酸酒精分化1～2 s后水洗返蓝；酒精脱水，二甲苯透明，封片。以PBS代替一抗作阴性对照；细胞胞浆着色呈棕黄色为阳性结果。图像选取及分析方法：MICRO-COSMOS MiVnT显微生物图像分析系统在统一光饱和度、亮度和色调条件下对所拍摄照片进行图像分析。取吸光度值计算平均数，用于各组间比较。

1.2.6Western-blotting检测GPR78表达 大鼠迅速断头取脑，冰上分离缺血侧顶叶大脑皮质约100 mg，冰上研磨组织后加预冷的蛋白裂解液，继续碾磨至液态，然后4℃，12 000 r/min离心30 min，留上清液，取40uL用BCA法进行蛋白定量测定，所剩上清液按4：1的比例加变性loading，100℃水浴10 min。取蛋白样品(40μg)采用10%SDS。PAGE 100 V垂直电泳(Bio-Rad)垂直板式电泳槽仪，(USA)120 min进行分离，然后转至硝酸纤维素膜(PVDF)上进行免疫反应(200V，120 min)。5%脱脂奶粉37℃封闭2 h，然后依次加入兔抗GRP78抗体(北京博奥森生物制剂有限责任公司，1：500)，37℃孵育2 h，4℃过夜；偶联辣根过氧化物(HRP)羊抗兔IgG(稀释浓度1:2 000)室温孵育2 h，LumiGLO(20×)发光剂中X一感光盒内曝光。以上反应均在塑料袋内进行，其间用PBS充分洗涤。为了检测蛋白裂解/转移的变化，所有的印迹均以丽春红(抗体孵育前)和考马斯亮蓝(化学发光法检测后)染色。胶片进行扫描和拍照，Quantity One图像分析软件进行蛋白量定量分析，以V值=GRP78蛋白定量/内参(β-actin)蛋白定量为结果，并进行统计学分析。

2 结 果

2.1脑缺血/再灌注后神经功能评分 假手术组大鼠神经功能评分为0分，其余两组在大鼠麻醉清醒后即出现不同程度神经功能缺损，与假手术组比较，缺血再灌注后的高血糖组与正常血糖组评分均升高,差异有统计学意义(P<0.05)，高血糖组功能评分较血糖正常组高。差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2各组TUNEL阳性细胞及凋亡比较 光镜下假手术组可见少量凋亡细胞(细胞核内可见棕黄色颗粒)，正常血糖组及高血糖组缺血侧坏死灶周围可见较多凋亡细胞。与假手术组比较，正常血糖组和高血糖组凋亡细胞数明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)，且高血糖组凋亡细胞较正常血糖组增多,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：A:假手术组；B:正常血糖组24 h；C:高血糖组24 h；图中棕黄色染色为凋亡细胞形态。图1 脑缺血再灌注后TUNEL染色(TUNEL,10×40)

2.3各组大鼠caspase-9和caspase-12表达 假手术组可检测到少量caspase-9，而caspase-12无表达。再灌注24 h后正常血糖组及高血糖组缺血侧顶叶皮质可见caspase-9和caspase-12表达明显增强。与假手术组比较，正常血糖组和高血糖组的caspase-9和caspase-12免疫组化染色灰度值均显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)，且高血糖组的caspase-9和caspase-12免疫组化染色灰度值较正常血糖组明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图2、图3。

表1 大鼠神经功能评分、凋亡细胞数及caspase-9、caspase-12表达水平比较

注：A:假手术组；B:正常血糖组24 h；C:高血糖组24 h；假手术组中未见表达，正常血糖组组可见明显棕黄色细胞数目，而高血糖组表达明显高于正常血糖组图2 脑缺血/再灌注caspase-12免疫组化染色(IHC,20×40)

注：A:假手术组；B:正常血糖组24 h；C:高血糖组24 h；假手术组中少量表达，正常血糖组组可见明显棕黄色细胞数目，而高血糖组表达明显高于正常血糖组图3 各组脑缺血/再灌注caspase-9免疫组织化学染色(IHC,20×40)

2.4鼠脑缺血/再灌注GRP78表达的变化 正常血糖组3 h表达升高，12 h时达到高峰，24 h 仍可见明显表达，高血糖组低于同时间点正常血糖组(P<0.01)。见表2、图4。

表2 大鼠再灌注后不同时间GRP78水平比较

图4 各组脑缺血/再灌注Western-blot

3 讨 论

高血糖是脑血管疾病发展和加重的重要危险因素，其损伤机制目前仍未明确，现有研究表明[5-7]，可能与兴奋性氨基酸的神经毒性、自由基生成增加、介导炎症反应和诱导细胞凋亡有关。其中，细胞凋亡在高血糖加重脑缺血再灌注损伤的众多机制中起着重要作用。研究发现:线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路等至少3条信号转导通路参与了凋亡[8]。脑缺血再灌注后神经细胞内质网应激反应是一个复杂的多因素过程，既有促进凋亡的caspase-9、caspase-12等因子的激活，也有抑制因子如GRP78等的变化[9]。本研究结果显示，与正常血糖组比较，高血糖组神经功能评分及凋亡细胞数显著增多。

凋亡是机体的一种生理过程，正常情况下有利于维持自身稳定，但异常增加则是某些损伤因素导致细胞死亡的主要形式。凋亡的机制在进化中由Caspase家族蛋白酶执行，caspase-9、caspase-12是caspase家族的重要成员，是内质网通路导致凋亡的关键因子，在缺血缺氧、Ca2+平衡失调等各种刺激过长过强时，Caspase-12前体被大量激活，并从内质网转移至细胞胞浆，依次激活凋亡启动因子Caspase-9引发caspase蛋白水解级联效应，发生细胞凋亡。在本实验中，正常血糖组各时点的凋亡指数、Caspase-12及其下游的Caspase-9表达较假手术组均明显增高，提示Caspase-9、Caspase-12在诱导脑缺血再灌注后的凋亡反应中起着重要作用。

GRP78是一种内质网伴侣蛋白，生理情况下，其在真核生内质网膜上与新生多肽短暂结合后分离，从而促进蛋白质的正确折叠和装配，故在生理状态下有微弱表达。脑缺血再灌注损伤时，激活了内质网应激，发生UPR(unfolded protein response,未折叠蛋白反应)。在应激早期，UPR诱导 GRP78大量表达，与内质网中错误折叠和未折叠蛋白结合，以恢复蛋白质的正确构象，使蛋白质能够在应激状态下继续正确合成，以维持内环境稳定，适应应激[10]。

在脑缺血再灌注后，内质网长时间过强应激则发生细胞凋亡，GRP78的表达呈下降趋势[11,12]。Tajiri等认为[13]，长时间的内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，导致内质网功能失代偿，细胞启动内质网相关凋亡程序的结果。GRP78后期表达下降，神经细胞凋亡严重，Vilatoba等在其实验中同样得到验证[14]。在本实验中，GRP78假手术组有少量表达，正常血糖组再灌注后3 h可见少量表达，高于假手术组，并在再灌注后12 h时达高峰，后期逐渐下降，与之前的实验相一致。

无论是动物实验[15]，还是临床资料[16]，都表明高血糖会加重缺血再灌注后的脑损伤。本实验中，高血糖组的神经功能评分及凋亡指数均高于正常血糖同时点组，提示高血糖状态下，凋亡更为严重，亦证实了细胞凋亡在高血糖加重脑缺血再灌注损伤中的作用。在脑缺血再灌注后，正常血糖组GRP78的表达水平均明显高于同时点高血糖组，提示在高血糖状态下GRP78的保护作用被明显抑制，而且可能在应激的早期这种抑制就已形成，说明高血糖在脑缺血再灌注后一方面抑制细胞内质网应激的保护机制，另一方面促进应激反应向凋亡转化。

综上所述，本研究结果显示，与正常血糖组大鼠相比，高血糖组大鼠脑组织，大鼠神经功能缺损更严重，神经细胞凋亡明显增多，高血糖组caspase-9、caspase-12表达比正常血糖同时点组均有明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)，且与凋亡情况变化一致，提示上调caspase-9、caspase-12表达，可能是高血糖加重脑缺血再灌注损伤的机制之一。但GPR78的表达减少，提示高血糖可增加缺血再灌注后脑细胞凋亡，GRP78可能参与了高血糖加重脑缺血再灌注损伤过程，下调GRP78表达可能是高血糖加重脑缺血再灌注损伤的机制之一。