甲状腺乳头状癌中SKA3蛋白的表达及其与预后、免疫细胞浸润的关系

杜春平，莫颖禧，曾丽霞，陈肖瑜，罗文奇，黄 静，马 韵

甲状腺癌是常见的内分泌恶性肿瘤之一，包含多种病理类型，其中甲状癌乳头状癌是最常见的类型[1-2]。纺锤体与着丝粒相关蛋白3(spindle and kinetochore associated protein 3, SKA3)参与介导动粒与微管的相互作用，并调节细胞的增殖和凋亡。SKA3在肿瘤中过表达，且与肿瘤细胞增殖和患者预后有关[3-4]。目前尚无SKA3在甲状腺癌中的研究报道。本实验通过免疫组化和多个甲状腺乳头状癌研究队列的大数据，分析SKA3在甲状腺乳头状癌中的表达、预后及其分子意义。

1 材料与方法

1.1 材料收集2019年6月～2020年4月广西医科大学附属肿瘤医院存档的行根治术的甲状腺组织标本，包括21例甲状腺乳头状癌和16例正常甲状腺组织。本实验经广西医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会审批，所有患者均知情同意。

1.2 免疫组化免疫组化染色采用SP法检测系统(北京中杉金桥公司，SP-9000)，SKA3抗体(Bioss公司，1 ∶800稀释，bs-7848R)。实验步骤严格按试剂盒说明书操作，EDTA抗原修复液修复。结果判读：着色强度呈浅黄色为1分，黄色为2分，黄褐色为3分，无阳性着色为0分；阳性细胞比例<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。上述两项结果乘积作为SKA3最终表达结果。分析人类蛋白质表达图谱(https://www.proteinatlas.org)中SKA3抗体(HPA039272)在20种肿瘤组织切片中的阳性率。

1.2 数据来源甲状腺乳头状癌队列分别来自基因芯片公共数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)的GSE3467队列和GSE33630队列；癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)(https://portal.gdc.cancer.gov)的THCA队列。GSE3467和GSE33630队列的基因表达芯片数据分别包含17例(肿瘤7例、配对正常标本7例)和90例(肿瘤45例、配对对照标本45例)。THCA队列的RNA测序数据和临床数据包含572例样本(肿瘤513例、对照标本59例)。

1.3 数据分析GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)软件分析SKA3 mRNA在GSE3467队列和GSE33630队列中的表达。UCSC Xena(https://xenabrowser.net)软件分析SKA3 mRNA在THCA队列中的表达。R软件(https://www.r-project.org)分析THCA队列的转录组数据，筛选与SKA3相关的差异表达基因。R软件对差异基因进行基因本体论(Gene ontology, GO)富集分析。TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer)软件分析THCA队列中肿瘤组织的RNA测序数据，分析SKA3与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等免疫细胞的关系。

1.4 统计学分析采用R软件进行统计学分析。t检验和ROC曲线分析SKA3蛋白表达，用平均数表示。秩和检验分析SKA3 mRNA表达及与临床病理特征的关系，用中位数表示。以SKA3 mRNA中位数为参照，分为低表达组和高表达组；Kaplan-Meier法和Log-rank检验比较SKA3低、高表达组间的预后。皮尔森相关检验筛选SKA3相关的差异表达基因，筛选标准为：P<0.05，r>0.4或<-0.4。皮尔森χ2检验分析SKA3与免疫细胞的相关性。

2 结果

2.1 癌组织中SKA3蛋白的表达免疫组化结果显示(图1)，与正常甲状腺组织(1.375±0.154 8)相比，SKA3蛋白在甲状腺乳头状癌组织(5.857±0.448 7)中的表达显著上调(P<0.001，图2)。ROC曲线示，SKA3具较高的诊断价值(AUC=0.981，图3)。SKA3在甲状腺乳头状组织中的阳性率高于其他肿瘤(图4)。

AB

图2 散点图分析SKA3蛋白在正常组织和甲状腺乳头状癌中的表达

图3 ROC曲线显示SKA3在甲状腺乳头状癌中的特异性和敏感性

图4 SKA3在20种肿瘤组织中的阳性率比较

2.2 癌组织中SKA3 mRNA的表达应用3个甲状腺乳头状癌队列，合计565例甲状腺乳头状癌组织和111例对照组织，分析SKA3 mRNA的差异表达。与正常甲状腺组织(GSE3467：5.783；GSE33630：5.166；THCA：2.555)相比，SKA3 mRNA在3个甲状腺乳头状癌队列中的表达均上调(GSE3467：6.012，P<0.001；GSE33630：5.530，P<0.001；THCA：3.792，P<0.001)(图5)。

图5 SKA3 mRNA在正常组织和癌组织的差异表达：A.GSE3467队列；B.GSE33630队列；C.THCA队列

2.3 SKA3与甲状腺乳头状癌临床病理特征和预后的关系THCA队列用于SKA3 mRNA与患者临床病理特征的分析，SKA3在N1期(3.981)的表达水平高于N0期(3.630)(P<0.001，图6)。SKA3在性别(P=0.626)、年龄(P=0.623)、病理分期(P=0.428)、T分期(P=0.707)、M分期(P=0.084)中的表达差异无统计学意义。SKA3高表达组的无瘤生存期(P=0.003)和无进展生存期(P=0.017)均低于低表达组(图7)；但在总生存率(P=0.393)和疾病特异生存率(P=0.741)方面差异无统计学意义。

图6 SKA3 mRNA在N分期中的表达分析

图7 SKA3表达与甲状腺乳头状癌患者预后的关系：A.无瘤生存期；B.无进展生存期

2.4 SKA3共表达基因及其功能生物信息学筛选获得与SKA3的共表达基因532个，其中正相关者有506个(P<0.05，r>0.4)，负相关者有26个(P<0.05，r<-0.4)。GO分析显示，这些基因参与的生物学过程主要是：细胞有丝分裂、细胞周期调控、细胞周期检查点、DNA损伤检查点、肿瘤坏死因子的产生、MAP激酶活性的调节、白细胞迁移、淋巴细胞迁移、淋巴细胞聚集、中性粒细胞迁移等。

2.5 SKA3与肿瘤免疫细胞浸润的关系TIME软件分析显示，SKA3与B细胞(P<0.001，r=0.415)、CD8+T细胞(P<0.001，r=0.255)、CD4+T细胞(P<0.001，r=0.271)、巨噬细胞(P<0.001，r=0.244)、中性粒细胞(P<0.001，r=0.426)和树突状细胞(P<0.001，r=0.51)的浸润水平呈正相关。

3 讨论

本实验用4个独立的甲状腺乳头状癌队列，比较SKA3在正常组织和肿瘤组织中的表达水平。SKA3在甲状腺乳头状癌中的表达显著上调，具有一定的诊断价值。甲状腺乳头状癌淋巴结转移率高，是肿瘤高复发的危险因素[5]。SKA3在N1期患者中的表达水平显著高于N0期患者，提示SKA3高表达可能与淋巴结转移或肿瘤复发有关。SKA3高表达组患者的无瘤生存期和无进展生存期低于低表达组，提示SKA3高表达患者的预后更差。综上所述，SKA3表达上调可能与甲状腺乳头状癌的发生和预后有关。

GO分析显示多种生物过程可能与SKA3基因有关，如细胞有丝分裂、细胞周期调控、细胞周期检测点等。SKA3是纺锤体与着丝粒相关蛋白复合体的重要亚基，与NDC80复合物共同控制和调节细胞的有丝分裂，对细胞的增殖和凋亡有调节作用[6]。GO分析还发现SKA3可能与肿瘤免疫细胞浸润有关。进一步分析发现，SKA3与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润水平呈正相关。肿瘤组织周围活化的免疫细胞可通过分泌促炎性细胞因子和趋化因子，以促进肿瘤细胞的增殖[7]。甲状腺癌中淋巴细胞浸润水平与免疫反应和细胞因子的分泌升高相关[8]。SKA3高表达患者的肿瘤免疫细胞增多，可能是影响其恶性生物行为，肿瘤浸润免疫细胞受宿主免疫状态的影响，可被药物有效靶向，并与免疫治疗的临床疗效相关[9-10]。

本实验结果提示，SKA3对甲状腺乳头状癌可能具有一定的影响，可能作为预后和治疗的标志物。