血清miR-127-3p 表达水平对原发性肝癌的诊断价值

王良波 李 坚 文绍吉

四川省巴中市中心医院普外科，四川巴中 636000

原发性肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，具有恶性度高、治愈率低及预后差等特点[1]。原发性肝癌临床症状主要有肝区疼痛或伴有一定消化系统症状，晚期可出现上消化道出血、肝昏迷等症状，严重可导致死亡[2]。大部分原发性肝癌患者确诊时往往是中晚期，治疗效果较差，因此，探索原发性肝癌发生的分子机制，尽早诊断与治疗对患者生存具有至关重要的意义。微小RNA（microRNA，miRNA）是一组长度为18～22 个核苷酸的非编码小RNA，它可以结合靶基因的3’-非翻译区的互补位点，从而诱导基因抑制和蛋白质降解等过程[3-4]。有研究显示[5]，miRNA 在人类癌症的发生发展中起着至关重要的作用，无论是致癌基因还是抑癌基因。如miR-363 在肝癌患者血清中呈低表达状态，通过靶向调控E2F3 调节肝癌细胞的生长，表明miRNA 可能通过调控原发性肝癌发展过程中相关信号传导途径来调节原发性肝癌的进展[6]。miR-127 是近年来研究的热点，与miR-136、miR-432 同属于1 个miRNA 簇，miR-127-3p 为其前体基因[7]。miR-127-3p 在多种肿瘤组织中均呈高表达状态，如乳腺癌、胃癌等[8-9]，并参与肿瘤的发生发展。但其在原发性肝癌中的具体作用机制尚不明确。本研究通过检测原发性肝癌患者血清miR-127-3p 的相对表达量，初步探讨其作用机制及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年6 月—2019 年5 月四川省巴中市中心医院（以下简称“我院”）住院治疗的原发性肝癌患者93 例为原发性肝癌组。纳入标准：①经病理检查明确诊断为原发性肝癌；②首次确诊。排除标准：①有心、脑等重要脏器疾病；②有严重感染疾病；③接受过抗肿瘤治疗。其中男66 例，女27 例；平均年龄（55.3±2.2）岁；≥55 岁48 例，＜55 岁45 例；低中分化51 例，高分化42 例；TNM 分期：Ⅰ期64 例，Ⅱ期16 例，Ⅲ期8 例，Ⅳ期5 例；有淋巴结转移40 例，无淋巴结转移53 例；肿瘤直径＜2.5 cm 47 例，≥2.5cm 46 例。TNM分期及病理分化程度参考第八版美国癌症联合会标准[10]。另选取我院同期体检的健康志愿者60 名为对照组，其中男30 例，女30 例；平均年龄（50.24±2.06）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

所有受试者晨起空腹抽取静脉血约4 mL，加入到促凝血管中，3000 r/min 离心10min，分离血清。提取总RNA（试剂盒购自美国Sigma 公司），将RNA 反转录为cDNA，反转录条件为：25℃10 min，50℃45 min，85℃5 min。再对cDNA 进行扩增，引物：miR-663，F：5’-TCGGATCCGTCTGAGCTTGGCT-3’，R：5’-CCAAGCTCAGACGGATCCGATT-3’。内参基因U6 作为对照，F：5’-GGTTAGAAGTCATACG-3’，R：5’-TGTCATGAATGATCC-3’。反应体系为：10 μL BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix（2×），2 μL cDNA 模板，1 μL上下游引物和6 μL H2O。产物扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性5 min，95℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40 个循环。采用2-ΔΔCt来计算和标准化miR-127-3p 的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t 检验；计数资料用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；受试者工作特征（ROC）曲线评价miR-127-3p 在原发性肝癌中的诊断效能。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-127-3p 相对表达量比较

原发性肝癌组miR-127-3p 的相对表达量为（0.301±0.010），低于对照组的（0.623±0.018），差异有高度统计学意义（t=126.540，P ＜0.001）。

2.2 原发性肝癌患者血清miR-127-3p 相对表达量与临床资料之间的关系

不同细胞分化程度、TNM 分期及有无淋巴结转移的原发性肝癌患者血清miR-127-3p 相对表达量比较，差异均有高度统计学意义（均P ＜0.01）。见表1。

表1 原发性肝癌患者血清miR-127-3p 相对表达量与临床资料之间的关系（）

表1 原发性肝癌患者血清miR-127-3p 相对表达量与临床资料之间的关系（）

2.3 血清miR-127-3p 相对表达量对原发性肝癌的诊断效能

结果显示，血清miR-127-3p 相对表达量诊断原发性肝癌的截断值为0.420，AUC 为0.793（95%CI：0.758～0.816，P ＜0.001），约登指数为0.71，灵敏度、特异性分别为0.860、0.850。见图1。

3 讨论

图1 血浆miR-127-3p 诊断原发性肝癌的ROC 曲线

原发性肝癌是目前全球范围内常见的恶性肿瘤，并且是全球第二大癌症相关死亡原因[11]。其发病原因尚不清楚，可能与病毒性肝炎、酒精性肝炎、肝硬化及家族遗传史有关[12]。原发性肝癌的治疗手段包括手术切除、动脉栓塞、射频消融及放化疗治疗等[13]。近年来，尽管医疗水平不断提高，但对早期原发性肝癌检出效果并不理想，因此探寻灵敏的肿瘤标志物已成为临床学者研究的重点。

miRNA 是近年来的研究热点，在细胞的生长发育过程中发挥了重要作用，其可以通过影响mRNA的转录及翻译来调节靶基因的表达，参与细胞的生长发育，参与肿瘤组织的发生、增殖及代谢等[14-16]。异常表达的miRNA 可影响多种生物学过程，如血管形成、癌症的发生及癌细胞的耐药性等[17-23]。miR-127 位于人染色体区域14q32.31 上，miR-127-3p 是由miR-127 的前体转录而来，在肿瘤细胞的生长分化过程中发挥了重要作用[24]。本研究结果显示，原发性肝癌患者血清miR-127-3p 相对表达量低于对照组（P ＜0.05），且miR-127-3p 的表达与肿瘤分期、细胞分化等有关。Wang 等[25]研究发现miR-127-3p 可通过调节靶基因ITGA6（整联蛋白alpha-6）抑制骨肉瘤细胞的增殖分化及迁移过程，而本研究并未对miR-127-3p的具体分子生物学机制进行研究，但miR-127-3p 在原发性肝癌进展中调控机制可能为：miR-127-3p 抑制Wnt/β-catenin 信号通路表达，下调WNT7A（Wnt 家族成员7A）的表达水平，对DNA 复制、转录具有较强的抑制作用，从而抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞的凋亡[26-27]；当人为敲低WNT7A 的表达时，对肿瘤细胞的生长分化、迁移及侵袭过程有明显的抑制作用[28-29]。此外，miR-127-3p 可抑制COA1（细胞色素C 氧化酶装配因子1）的表达，阻碍细胞核酸及蛋白质合成，进一步抑制肿瘤细胞的形成及增殖过程[30-31]。ROC 结果显示，AUC＞0.7，敏感度和特异性分别为0.860、0.850。提示miR-127-3p 的表达对原发性肝癌具有一定诊断价值，可作为诊断原发性肝癌诊断的分子标志物。但本研究样本量较小，有待多中心大批量标本进行后续研究。

综上所述，原发性肝癌患者血清中miR-127-3p呈低表达，在不同肿瘤分期、细胞分化程度及有无淋巴结转移之间存在差异表达，可作为诊断原发性肝癌诊断的分子标志物。