射麻口服液治疗新型冠状病毒肺炎作用机制的网络药理学探讨

封继宏 谭旺晓 张 硕 金世元 毕明达 秦云普 赵 坤

1.天津中医药大学第二附属医院呼吸与危重症医学科，天津 300150；2.天津中医药大学中医药研究院，天津 300193；3.北京市卫生学校，北京 100053；4.海南中盛合美生物制药有限公司，海南海口 570100

新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）是指感染2019 新型冠状病毒（SARSCoV-2）引起的肺炎，主要症状为发热、咳嗽、肌痛或疲劳，主要通过呼吸道飞沫和接触传播[1]。其迅速蔓延至全国及世界其他地区，对人民的生命财产及社会的稳定造成了严重的影响[2]。目前全球疫情仍未得到有效控制，尚无针对COVID-19 的特效药，而我国中西结合疗效显著，为全球提供了中医药抗疫经验[3]。

射麻口服液是在《伤寒杂病论》麻杏石甘汤的基础上加减而成，由麻黄、胆南星、石膏、桑白皮、射干、莱菔子、苦杏仁、白前、黄芩、五味子组成，具有清肺化痰、止咳平喘的功效。在抗击COVID-19 疫情中，《福建省新型冠状病毒肺炎中医诊疗专家共识》[4]、《北京市新型冠状病毒肺炎中医药防治方案（试行第四版）》[5]均将射麻口服液列为推荐中成药。因此，研究射麻口服液治疗COVID-19 的作用机制对指导其临床应用具有重要意义。

本研究基于网络药理学的方法初步探讨射麻口服液治疗COVID-19 可能的作用机制，为其更广泛地用于治疗COVID-19 提供理论依据，并为更加深入地理解中医药防治COVID-19 提供科学指导。

1 资料与方法

1.1 资料

中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、人类基因数据库GeneCards（https：//www.genecards.org/）、STRING 数据库（https：//string-db.org/）和蛋白质靶点数据库Uniprot（http：//www.uniprot.org/）；网络分析工具Cytoscape 3.7.2 和IPA 分析软件（http：// www.ingenuity.com）。

1.2 射麻口服液活性成分及作用靶点筛选

利用TCMSP 检索射麻口服液中麻黄、天南星、石膏、桑白皮、射干、莱菔子、苦杏仁、白前、黄芩、五味子的化学成分，检索时间截至2020 年3 月25 日；并以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18 为参数筛选活性化合物。通过TCMSP 数据查询活性化合物的作用靶点，借助Uniprot 数据库对靶点进行标准化。

1.3 疾病靶点收集

基于GeneCards 数据库，以“novel coronavirus pneumonia”为关键词进行检索，获取COVID-19 相关的靶基因，检索时间截至2020 年4 月2 日。

1.4 射麻口服液治疗COVID-19 的潜在作用靶点预测

将射麻口服液的作用靶点和COVID-19 的靶点进行映射，筛选出共同靶点，作为射麻口服液治疗COVID-19 的潜在作用靶点。

1.5 药物-成分-靶点-疾病网络构建

将“1.4”中得到的潜在作用靶点及其相对应的活性成分和成分对应的中药导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建药物-成分-靶点-疾病相互作用网络，采用Network Analyzer 功能对网络进行分析。

1.6 蛋白相互作用（PPI）网络构建及分析

在STRING 数据库中输入射麻口服液治疗COVID-19 的潜在作用靶点，进行PPI 分析，利用Cytoscape 3.7.2 软件进行网络构建，并通过CytoHubba 功能对节点的度值（Degree 值）进行分析，提取关键子网络。

1.7 靶点功能及通路富集分析

将靶点上传至IPA 进行Core Analysis，采用STRING 数据库对潜在作用靶点进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析。

2 结果

2.1 射麻口服液的活性成分及作用靶点

通过TCMSP 数据库检索射麻口服液中10 味中药的化学成分，根据OB≥30%、DL≥0.18 筛选出活性化合物148 个，见图1A。去重后得到106 个活性成分，按照OB 值排名前20 的活性成分见表1。通过TCMSP数据库匹配到853 个作用靶点，每味中药对应靶点数见图1B。靶点去重并进行标准化后得到265 个靶点。

图1 射麻口服液活性成分及对应靶点数量

表1 射麻口服液中OB 值前20 的活性成分基本信息

2.2 射麻口服液治疗COVID-19 的潜在作用靶点

通过GeneCards 数据库检索得到COVID-19 相关靶点259 个，将其与射麻口服液的作用靶点取交集，得到53 个共同靶点。见图2。

2.3 药物-成分-靶点-疾病网络

采用Cytoscape 3.7.2 软件构建药物-成分-靶点-疾病网络，见图3。采用Network Analyzer 对网络进行分析，按照Degree 值定义节点的大小，如图3 所示，其中槲皮素（MOL000098）、β-谷甾醇（MOL000358）、木犀草素（MOL000006）、山奈酚（MOL000422）、汉黄芩素（MOL000173）、豆甾醇（MOL000449）、柚皮素（MOL004328）、金合欢素（MOL001689）、黄芩素（MOL 002714）均能与10 个以上的靶点连接，而在53 个潜在作用靶点中，PTGS2、PTGS1、NOS2、DDP4、PIK3CG、CASP3、BCL2、MAPK14、RELA 等靶点又能与10 个以上的成分连接。

2.4 PPI 网络

图2 射麻口服液作用靶点和COVID-19 靶点交集

图3 药物-成分-靶点-疾病网络图

使用STRING 平台对53 个潜在作用靶点进行分析，用Cytoscape3.7.2 软件构建PPI 网络图，见图4（封三）。图中节点面积、颜色表示靶点的Degree 值大小，面积越大、颜色越趋于暖色的节点对应靶蛋白的Degree 值越高；边的粗细、颜色表示连接评分，边越粗、颜色越趋于冷色评分越高，关系越密切，节点之间的边数越多表示靶点之间的关联度越大。同时运用CytoHubba 插件对靶点的Degree 值进行排序，筛选出Degree 值≥30 的靶蛋白14 个，包括MAPK3、TP53、TNF、IL -6、MAPK8、CASP3、MAPK1、IL -10、CXCL8、CCL2、MAPK14、PTGS2、IL-1B、IL-4，并提取关键子网络，见图5。Degree 值大的靶点在网络中起着关键作用，说明这14 个靶蛋白是PPI 网络的核心靶点。

图4 蛋白相互作用网络图

图5 蛋白相互作用关键子网络

2.5 靶点功能分析

IPA 分析得到500 条靶点相关的疾病和生物学功能信息，按照P 值排序，主要涉及细胞死亡和存活（cell death and survival）、机体损伤和异常（organismal injury and abnormalities）、炎症反应（inflammatory response）、免疫细胞转运（immune cell trafficking）等。见图6。

图6 射麻口服液治疗COVID-19 潜在靶点的疾病与生物功能热图

2.6 靶点通路分析

KEGG 富集分析得到169 条信号通路，主要涉及微生物感染、炎症应答、氧化还原等生物过程。前20 条通路中共有14 条通路与免疫炎症、病毒感染、细菌和寄生虫感染相关，主要涉及白细胞介素-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、甲型流感（influenza A）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、肺结核（tuberculosis）等信号通路，此外还涉及缺氧诱导因子-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）、凋亡通路（Apoptosis）及癌症相关通路，见图7（封三），其中绿色字体为免疫炎症相关通路。

图7 射麻口服液治疗新型冠状病毒肺炎的KEGG 通路富集气泡图

为了进一步探究射麻口服液的作用机制，将与免疫炎症、病毒感染、细菌和寄生虫感染相关的14 条信号通路和对应的40 个靶蛋白导入Cytoscape 构建靶点-信号通路作用网络，见图8（封四）。根据Degree 值调节靶蛋白的大小和颜色，面积越大、颜色越深的靶蛋白Degree 值越大，即在网络中的作用越重要。如图所示，筛选出TNF、IL-6、RELA、MAPK8、MAPK3、MAPK1、MAPK14、IL1B、CXCL8 等9 个主要靶蛋白，均参与调节10 条以上的信号通路，并且均与白细胞介素-17 信号通路、Toll 样受体信号通路和NOD 样受体信号通路有关。而在PPI 网络中，MAPK3、TNF、IL6、TP53、CASP3、MAPK8、IL10、CXCL8、PTGS2、MAPK1、CCL2、IL1B、MAPK14、IL4 是网络中的核心靶点，两组靶点映射，推测除了PTGS2、PTGS1、NOS2、DDP4、PIK3CG、CASP3、BCL2、MAPK14、RELA 外，射麻口服液还可能通过调节MAPK3、TNF、IL6、MAPK8、CXCL8、MAPK1、IL1B 等靶点发挥治疗COVID-19 的作用。

3 讨论

中医药防治瘟疫具有悠久的历史，总结了大量的临床用药经验。自COVID-19 疫情发生以来，中医药治疗效果显著。射麻口服液作为福建、北京等地区防治方案的推荐用药，可用于治疗以咳嗽、痰多稠黏、胸闷憋气等为主要症状的COVID-19 疫毒袭肺证。本研究基于网络药理学探究射麻口服液治疗COVID-19的作用机制。

通过构建药物-成分-靶点-疾病作用网络分析发现，槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素、豆甾醇、黄芩素等在网络中的关联度较高。已有研究表明，槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、黄芩素均能与SARS-CoV-2 3CL 水解酶和血管紧张素转化酶Ⅱ较好地结合，其结合能力与治疗COVID-19的临床推荐用化学药瑞德西韦、利托那韦等相近，甚至优于化学药[6-7]，说明这些化合物可能是射麻口服液治疗COVID-19 的潜在物质基础。有研究表明槲皮素可降低炎症因子IL-6 和IL-1β 的释放[8]，改善肺纤维化[9]。木犀草素具有较强的体外抑制流感病毒的活性[10]，并可减轻LPS 诱导的支气管肺炎损伤[11]。山奈酚可防治甲型流感病毒诱导的肺内屏障功能障碍[12]，而黄芩素和汉黄芩素可改善甲型流感病毒诱导的急性肺损伤[13]。以上研究结果提示，射麻口服液的活性成分具有抗病毒、抗炎、保护肺脏的作用，其可能通过多种成分的协同作用改善COVID-19 引起的炎症反应及肺损伤。

PPI 网络分析及深入的靶点-通路网络分析发现，MAPK3、TNF、IL-6、MAPK8、CXCL8、MAPK1、IL-1B等靶点可能是射麻口服液作用的核心靶点。当机体感染微生物或受到其他外界强烈刺激后，免疫系统被过度激活，从而引起多种细胞因子迅速大量产生而诱发细胞因子风暴，即炎症风暴[14]。研究发现，COVID-19患者体内存在强烈的免疫反应和细胞因子风暴，失控的炎症风暴是造成肺损伤及肺炎发生发展的重要原因[15]。而促炎性细胞因子IL-6 是引发炎症风暴的关键炎症因子之一，重症患者体内IL-6 的水平明显升高[16-17]。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》[18]已将IL-6 作为重型、危重型COVID-19 患者的临床预警指标。本研究发现IL-6 可能是射麻口服液治疗COVID-19 的潜在作用靶点，木犀草素、槲皮素、汉黄芩素等成分均可作用于IL-6，提示射麻口服液可能通过抑制IL-6 进而阻断炎症风暴，从而阻止患者向重型、危重型转变。TNF、IL-1B 等炎症因子均参与细胞因子风暴的发生发展，临床报道COVID-19 患者体内TNF-α、IL-1B 的水平也显著升高[15]，提示抑制TNF-α、IL-1B 等炎症因子的释放亦是阻断炎症风暴的有效手段。因此，射麻口服液可能通过调节IL-6、TNF-α 等细胞因子的释放，影响炎症风暴的发生发展，从而发挥治疗COVID-19 的作用。

KEGG 富集分析得到169 条信号通路，主要涉及微生物感染、炎症应答、氧化还原等生物过程。进一步分析发现，前20 条通路中，4 条通路与免疫炎症相关，10 条通路与病毒感染、细菌和寄生虫感染相关，说明射麻口服液在抗病毒感染、调节炎症方面具有重要的作用，可能是其抗COVID-19 的原因。通过靶点-通路分析发现，核心靶点主要富集在IL-17、Toll 样受体和NOD 样受体信号通路。IL-17 对宿主的免疫反应至关重要[19]，脓毒症诱导的急性肺损伤患者IL-17的含量明显升高，阻断IL-17 信号通路可以降低肺部炎症反应改善肺损伤[20-21]。TNF 在维持细胞、组织和机体内环境平衡中起重要作用[22]，其中TNF-α 是急性病毒性疾病中关键的细胞因子，其可通过失控的炎症反应加重冠状病毒的致病性[14]，抑制TNF-α 信号，可缓解SARS 病毒感染小鼠的组织损伤[23]。在本研究中，TNF 信号通路与射麻口服液对应的IL-6、TNF、IL-1B等16 个靶蛋白相关。而Toll 样受体信号通路在先天免疫应答和抗原特异性获得免疫中发挥着重要作用，研究表明激活Toll 样受体信号通路可以保护流感病毒的感染[24]。本研究结果显示，IL-17、TNF 和Toll 样受体信号通路是射麻口服液调节的重要免疫炎症相关通路，涉及IL-6、TNF、MAPK8、CXCL8 等核心靶点，推测射麻口服液可能通过调节这些靶点进而调控IL-17、TNF、Toll 样受体通路抑制免疫炎症反应，进而改善SARS-CoV-2 感染引起的肺损伤。此外，COVID-19患者由于病毒感染引起的肺部炎症容易导致机体血氧降低，严重则可引发低氧血症[15]。当机体缺氧时HIF-1 被活化，介导缺氧代偿性反应、血管新生、免疫反应等使机体更好地适应低氧环境[25]。有研究显示HIF-1 信号通路在慢性阻塞性肺疾病患者中被激活，其可能是慢性阻塞性肺疾病治疗的潜在靶点[26]。推测HIF-1 信号通路可能与COVID-19 患者的低氧血症相关，射麻口服液可能通过调节HIF-1 信号通路减少缺氧对机体造成的损伤。由此可见，射麻口服液可能通过多种生物学通路，调节机体的免疫炎症反应、缺氧损伤、细胞凋亡等病理过程，对抗病毒感染，起到治疗COVID-19 的作用。

综上，本研究运用网络药理学的研究方法初步探讨了射麻口服液治疗COVID-19 的作用机制，射麻口服液中的槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇等活性成分可能通过作用于IL-6、TNF、MAPK8、MAPK3、MAPK1、IL-1B 等靶点，进而调节IL-17、TNF、Toll 样受体及HIF-1 信号通路等多条通路发挥抗病毒、抗炎、免疫调节、保护缺氧损伤等作用，治疗COVID-19，体现了中药多成分、多靶点、多途径的整合调节作用。本研究为射麻口服液的临床应用提供了科学依据，并为进一步的实验研究奠定了基础。