测定血液病患者血浆Venetoclax浓度的HPLC-MS/MS方法

王磊 代玉超 李梦 刘红星，，4★

Venetoclax 是一种BCL-2 通路抑制剂，用于慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤（chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma，CLL/SLL）和急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者的抗肿瘤治疗［1］。体外研究表明Venetoclax 主要由CYP3A4 代谢，与酮康唑、泊沙康唑和利福平等有较强的药物相互作用，个体间血药浓度差异较大［2-3］。通过检测患者Venetoclax 血药浓度，并个体化地调整给药剂量，可减少不良反应和保障临床疗效［4-5］。本研究拟建立一种液相色谱串联质谱（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法测定血液病患者血浆Venetoclax 浓度的方案，并应用于临床治疗药物监测，为Venetoclax 的个体化用药剂量调整提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 分析仪器

岛津NexeraXp 型高效液相色谱仪（日本岛津公司），API3200 MD 三重四级杆质谱仪（美国AB SCIEX 公司），质谱仪采用电喷雾（ESI）离子源，分析软件为Analyst®MD 1.6.3。

1.1.2 试剂

标准品：Venetoclax（批号：1-NWY-41-1，TORONTO RESEARCH CHEMICALS INC，加拿大）；内标：Venetoclax-d8（批号：02-Jun-17-01，Clearsynth，印度）。甲醇（HPLC-Grade，fisher，美国），乙腈（HPLCGrade，fisher，美国），DMSO（二甲基亚砜，Lot：WXBC1590V，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司），甲酸（HPLC Grade，北京迈瑞达科技有限公司）；乙酸铵（HPLC Grade，北京迈瑞达科技有限公司）。

1.1.3 基质及临床样本

空白血浆基质为新鲜小牛血清（北京百奥莱博科技有限公司）。收集本院7 名服用Venetoclax的CLL 患者的血液样本，均为300 mg qd 服药，于服药6 h 时抽血检测峰浓度。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

采用月旭Ultimate@XB-C18液相色谱柱（4.6×50 mm，5μm），柱温60℃；流速：0.7 mL·min-1；液相流动相为：A 相为含2 mmol·L-1乙酸铵+0.1%甲酸的水溶液；B 相为含0.1%甲酸的甲醇溶液。样本进样量为3 μL。洗脱方式为梯度洗脱，B 相浓度从（0.01～1.0）min 由60%～95%，从（1.0～2.5）min 维持95%浓度，从（2.5～2.6）min，B 相浓度由95%～60%，维持60%浓度到3.5 min 结束。

1.2.2 质谱条件

选用电喷雾离子源（ESI+），以多离子反应监测方式（MRM）进行检测。其离子源参数为离子喷射电压：4 500 V，离子源温度：550℃，喷雾气：50 psi，辅助加热气：55 psi，气帘气：20 psi，碰撞气：Medium。同时监测Venetoclax m/z 868.5～321.7 作为定量离子，Venetoclax m/z 868.5～177.6 作为定性离子；监测Venetoclax-d8m/z 876.6～329.4 作为内标定量离子。见图1、表1。

图1 Venetoclax 与Venetoclax-d8 的二级质谱图Figure 1 Secondary mass spectrometry of Venetoclax and Venetoclax-d8

表1 质谱条件Table 1 Mass spectrometry conditions

1.2.3 溶液配制

1.2.3.1 储备液的配制 取Venetoclax 标准品5.000 mg，用DMSO 充分溶解，配制成浓度为0.5 mg·mL-1的储备液；同样取Venetoclax-d8标准品1.000 mg，选用DMSO 与甲醇溶剂，充分溶解，配制成浓度为100 μg·mL-1溶液，分装，备用。

1.2.3.2 标准品与内标溶液的配制 取0.5 mg·mL-1的Venetoclax 储备液，用有机溶液（50%乙腈+10%DMSO）稀释成浓度为0.1、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL-1的Venetoclax 标准品系列溶液。然后取配置好的Venetoclax-d8储备液，用甲醇稀释，制得浓度为250 ng·mL-1Venetoclax-d8内标溶液。

1.2.4 样品处理

将患者血液样本3 500 r·min-1离心10 min，取100 μL 血浆上清，加至1.5 mL 离心管中，加入100 μL 含0.1%甲酸和2 mmol·L-1乙酸铵的水溶液，再加入300 μL 配制好的Venetoclax-d8内标溶液，涡旋60 s，充分混匀，13 000 r·min-1离心10 min。吸取上清液于进样瓶中，进样3 μL。

1.2.5 方法学验证［6-9］

1.2.5.1 专属性考察 采用上述实验方法，分别取空白血浆、加入Venetoclax及Venetoclax-d8的空白血浆、给药后的患者血浆。按“1.2.4”项方法操作，进行检测。

1.2.5.2 残留验证 在分析高浓度样品后，立即测定空白样品来评价方法残留。

1.2.5.3 基质效应评价 分别添加3 个浓度水平的标准溶液到空白血浆和水中，按1.2.4 项进行处理，通过血浆存在下目标化合物（内标）的信号强度与水中目标化合物（内标）的信号强度来计算内标归一化的基质因子，进而评价基质效应，计算公式参照中国药典［9］。

1.2.5.4 标准曲线绘制和定量限 取10 μL 浓度为0.1、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL-1的Venetoclax 标准品系列溶液，分别加入1.5 mL 离心管中，再平行加入90 μL 空白血浆，然后按照1.2.4 操作，经HPLC-MS/MS 分析，以Venetoclax 与内标Venetoclax-d8峰面积之比（Y）作纵坐标，以血浆Venetoclax 浓度X为横坐标，用加权（W=1/X2）最小二乘法进行回归和线性拟合。

1.2.5.5 线性评价

通过评价3 条标准曲线，每天1 条标准曲线，计算线性回归的相关系数r，要求r≥0.99。

1.2.5.6 精密度 制备高、中、低（1 500，300，30 ng·mL-1）3 种浓度的质量控制（quality control，QC）样品各6 个，按1.2.4 项下进行处理，连续测定3 d，根据QC 样品测定浓度结果计算批内和批间精密度，要求CV＜15%。

1.2.5.7 回收率 取空白血浆，制备高、中、低3 个质量浓度的质控血浆样品，各6 个，按1.2.4 项下进行处理，测定得到分析物及内标峰面积数值比值A1；同时取空白血浆，经蛋白沉降处理得血浆上清，然后制备高、中、低3 个质量浓度的质控血浆上清样品，各6个，按1.2.4 项下进行处理，测定得到分析物及内标峰面积数值比值A2，以A1/A2比值计算提取回收率。

1.2.5.8 稳定性试验 配制Venetoclax 低、中、高3个浓度（30，300，1 500 ng·mL-1）的血浆样品，每个浓度3 个样品，考察其在室温放置12 h、冰箱4 度放置12 h、进样板放置12 h、反复冻融3 次稳定性。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0 软件进行统计分析。计量资料中正态分布数据采用（±s）表示，非正态分布数据采用中位数（四分位数间距）进行描述；计数资料采用n（%）表示，结合方法学要求对性能验证实验数据进行相关性分析。

2 结果

2.1 专属性考察

Venetoclax 保留时间为1.88 min，内标Venetoclax-d8保留时间为1.83 min，二者色谱行为一致；空白血浆中内源性物质无出峰。见图2。

图2 Venetoclax 和Venetoclax-d8色谱图Figure 2 Chromatogram of Venetoclax and Venetoclax-d8z

2.2 残留验证

Venetoclax残留在3%左右，小于分析物定量下限20%，内标残留为0，低于内标峰面积的5%。见表2。

2.3 基质效应评价

有或无血浆基质中不同加标浓度Venetoclax内标归一化基质因子在0.93～1.00 之间，CV 在4%～9%之间，小于15%。见表3。

表2 Venetoclax 残留实验评价结果Table 2 Residual experiment evaluation results of Venetoclax

表3 Venetoclax 基质效应考察评价结果Table 3 Matrix effect evaluation results of Venetoclax

2.4 标准曲线的绘制和定量限

采用内标法进行定量分析，得到的直线方程为Y=0.002 01X+0.001 64，r=0.999 5。表明Venetoclax 在10～2 000 ng·mL-1内线性关系良好，最低定量限为2 ng·mL-1。

2.5 线性评价

Venetoclax 连续3 个批次标准曲线方程分别为Y=0.001 89X+0.000 526，r=0.995；Y=0.002 01X+0.001 64，r=0.999 5；Y=0.001 75X+0.006 63，r=0.998 8。表明每批标准曲线相关系数r≥0.990，三条线性数据整合通过统计学方法计算得到线性方程Y=0.001 87X+0.003 15，r=0.996 7。

2.6 精密度

Venetoclax 批内RSD 为2.77%～6.10%，批间RSD 为4.91%～5.23%，二者均小于15%，结果精密度好，数据较集中。见表4。

2.7 回收率

Venetoclax 和Venetoclax-d8的面积比例系数数值进行计算，得回收率在101.68%～105.38%之内，位于85%～115%之间。见表5。

2.8 稳定性试验

在以上考察的稳定性条件下，对结果数据进行单因素方差分析，其Venetoclax 浓度数据0.92%≤RSD≤6.56%＜15%。见表6。

表4 Venetoclax 精密度测定结果（n=6）Table 4 Precision measurement results of Venetoclax（n=6）

表5 Venetoclax 回收率测定结果（n=6）Table 5 Recovery results of Venetoclax（n=6）

表6 Venetoclax 稳定性实验结果（n=3，±s）Table 6 Stability experiment results of Venetoclax（n=3，±s）

表6 Venetoclax 稳定性实验结果（n=3，±s）Table 6 Stability experiment results of Venetoclax（n=3，±s）

放置条件浓度（ng/mL）室温放置12 h冰箱4 度放置12 h进样板放置12 h冻融稳定性测得浓度（ng/mL）RSD（%）测得浓度（ng/mL）RSD（%）测得浓度（ng/mL）RSD（%）测得浓度（ng/mL）RSD（%）30 36.37±0.72 1.99 34.90±1.56 4.48 33.13±1.42 4.27 33.57±1.76 5.25 300 330.33±3.06 0.92 324.00±7.94 2.45 319.00±8.66 2.71 321.33±7.51 2.34 1500 1490.00±26.46 1.78 1526.67±51.32 3.36 1416.67±92.92 6.56 1540.00±43.59 2.83

2.9 临床应用

应用上述建立的HPLC-MS/MS 法对血浆Venetoclax 浓度进行检测，得到7 例患者Venetoclax 血药浓度结果分别为：654、940、398、760、406、1110 和1870 ng·mL-1，可看出同一剂量下不同患者中，其血药浓度差别较大，但其平均值为877 ng·mL-1，与其药代动力学结论一致。

3 讨论

Venetoclax 与三唑类等药物联用时，其体内过程受三唑类药物影响较大，患者易出现恶心，腹泻，血小板减少等不良反应，应在Venetoclax 相应治疗周期内减少Venetoclax 剂量［10］。临床建议实验室开展Venetoclax血药浓度检测，以便临床更好的调整Venetoclax给药剂量。血药浓度测定方法一般有色谱法，免疫法和HPLC-MS/MS 法。目前关于Venetoclax 血药浓度测定的文献较少，且其方法均为HPLC-MS/MS法。

Salem［11］和Liu 等［12］于2017年建立了测定Venetoclax 血药浓度的HPLC-MS/MS 法，但他们报道的方法前处理过程复杂、耗时长，且重复性不好、效率低；流动相为乙腈/甲酸铵水溶液，色谱柱较长，分析时间长，且无合适的内标可选择。Inturi等［13］于2018年报道的方法用同位素Venetoclax-d8作为内标，但分析时间较长（每个样品需13 min）；其采用挥发性太强且不安全的乙醚溶解Venetoclax。本文采用二甲基亚砜溶解Venetoclax，以克服Venetoclax 本身溶解性差的难题。本文采用在血浆中加入100 μL 含0.1%甲酸和2 mmol·L-1乙酸铵的水溶液作为前处理液，甲醇沉淀蛋白效果更好，回收率更高且样本检测更稳定。实验数据证明，本文建立的Venetoclax 血药浓度检测方法专属性强、精密度好、准确度高、稳定性好、线性范围宽、无残留，同时具有前处理简单，耗时短，重复性好等特点，可用于临床常规血药浓度测定。

鉴于目前Venetoclax 血药浓度监测在临床治疗药物监测中尚无相关指南或共识可供借鉴，故本实验建议临床可参考其药物代谢动力学参数来进行调整Venetoclax 给药剂量［1-5，10-17］。一般建议在低脂肪餐条件下，Venetoclax 400 mg qd 剂量，在服药后6 h（峰值）左右抽血送检。Venetoclax 稳态Cmax为2.1±1.1 μg·mL-1，可作为临床调整剂量的依据。当Venetoclax 与中强度CYP3A 抑制剂及诱导剂和P-gp 抑制剂联用，或患者服用的药物来源不清时，最好监测血药浓度。通过对Venetoclax 整个治疗周期不同给药剂量下血药浓度结果回顾性分析，统计出相应的血药浓度有效范围，可为临床合理用药提供参考依据。