钙蛋白酶-1表达水平与结直肠癌患者病理特征及疾病进展风险的相关性

徐金平 苏玲 史盼成 惠奕★ 常剑

结直肠癌是常见的胃肠道恶性肿瘤，其发病率和死亡率在消化道疾病中仅次于食管癌、胃癌和原发性肝癌［1］。可以通过淋巴、血液循环及直接蔓延等途径转移。早发现、早诊断和手术根治是治疗的关键。有文献指出［2］内镜下黏膜切除术或黏膜剥离术术后患者5年生存率可达90%，但仍存在一定的疾病进展风险。钙蛋白酶-1 是一组钙激活的非溶酶体中性半胱氨酸蛋白酶，已经证实，钙蛋白酶参与细胞增殖、分化、迁移等过程，并参与了癌发病机理和进展过程中。据报道［3］，钙蛋白酶-1 与癌细胞的凋亡有关，此外，钙蛋白酶-1 的上调可能促进了癌症的发展和转移。在大肠腺癌、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤组织中钙蛋白酶-1 被证实均处上调状态，在Wang［4］的研究中指出钙蛋白酶-1 是胃癌的预后标志物。此前有报道称钙蛋白酶在大肠腺癌中呈高表达［5］。基于此，本研究探讨钙蛋白酶-1 表达水平与结直肠癌患者病理特征及疾病进展风险的相关性。

1 资料和方法

1.1 临床资料

选取2017年2月至2018年9月就诊的107 例结直肠癌手术患者，其中男性患者48 例，女性患者56 例；平均年龄（66.74±8.69）岁；病程6～14 个月，平均病程（10.74±2.11）月。入院时收集患者临床病理资料及钙蛋白酶-1 水平；术后均根据患者肿瘤分期及部位等接受术后辅助治疗，随访1年，截至末次随访时间2019年9月共有3 名患者因不同原因失访，剩余104 例患者均完成随访，其中36 例患者出现疾病进展为进展组，其中术后死亡6 例，术后复发16 例，术后病理分期增加14 例；68 例未出现疾病进展定义为无进展组。

纳入标准：①符合结直肠癌诊断标准的患者，术后病理学检查确诊为结直肠癌［6］；②ASA［7］等级Ⅰ～Ⅱ者；③临床资料完整；④签署知情同意书；④术前未进行新辅助治疗；⑤原发性结直肠癌。排除标准：①合并其他器官或组织肿瘤；②合并严重心血管系统疾病；③先天性肠道畸形者；④依从性差，不配合随访者。本实验经医院伦理委员批准。

1.2 方法

①所有入组患者均参照2018年版中华医学会与中国抗癌协会制定的《腹腔镜结直肠癌根治手术操作指南》［8］的手术方案进行手术治疗，术后均根据患者肿瘤分期及部位等参照《中国结直肠癌诊疗规范（2017年版）》［9］的治疗方案接受术后辅助治疗。②钙蛋白酶-1 水平检测：利用免疫组织化学染色技术，经10% 中性甲醛溶液固定，石蜡包埋以5 μm 切片。采用SP 法，以PBS 代替一抗为阴性对照。标本经二甲苯脱蜡、乙醇水化，完成后浸于乙二胺四乙酸中微波抗原修复；冷却至室温后充分水洗，采用PBS 浸洗；滴加山羊血清封闭液；加入钙蛋白酶-1 抗体于4℃孵育过夜；使用PBS 冲洗，使用通用型SP 900 生物标记素标记二抗；DAB 显色后，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片镜检。评分标准［10］：计数阳性细胞百分比，＜25%为0 分，25～50%为1 分，50～75%为2 分，＞75%为3 分。细胞着色轻度：无着色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色2 分，棕褐色为2 分。以阳性细胞百分比得分×着色强度得分为最终评分，0～3 分为低表达，＞3 分为高表达。见图1。

1.3 观察指标

图1 钙蛋白酶-1 在不同分期结肠癌组织中的表达Figure 1 Expression of calproteinase-1 in different stages of colon cancer

①于患者入院时收集患者临床资料，包括年龄、性别、BMI 等。②利用免疫组织化学染色技术比较两组患者肿瘤细胞中钙蛋白酶-1 表达水平。②记录患者肿瘤部位、T 分期、N 分期、M 分期、肿瘤分化程度、转移情况等。③疾病进展：将术后死亡、术后复发、病理分期增加等定义为疾病进展。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0 统计软件对数据进行分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料采用n（%）表示，采用χ2检验，等级资料使用秩和检验；采用Logistic 回归方程分析影响结直肠癌患者疾病进展的的独立预测因素，绘制工作特征曲线（ROC）评估钙蛋白酶-1 对结直肠癌患者疾病进展的的预测价值，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床资料比较

两组患者一般资料及肿瘤部位、N 分期、M 分期、肿瘤分化程度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），钙蛋白酶-1、淋巴转移、T 分期组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 钙蛋白酶-1水平与结直肠癌患者疾病进展的关系

检测两组患者钙蛋白酶-1 水平发现，在进展组患者中钙蛋白酶-1 表达水平呈高表达（0.90±0.12）；无进展组表达水平呈低表达（0.81±0.10），两组比较差异有统计学意义（t=3.848，P＜0.05），见图2。

2.3 结直肠癌患者疾病进展风险的预测因素分析

Logistic 多因素显示T 分期、淋巴转移、钙蛋白酶-1 是结直肠癌患者疾病进展风险的独立预测因素。见表2。

2.4 钙蛋白酶-1预测结直肠癌疾病进展风险的效能

钙蛋白酶-1 预测结直肠癌疾病进展风险的AUC为0.716，高于T 分期、淋巴转移。见图3、表3。

3 讨论

钙蛋白酶是保守半胱氨酸蛋白酶家族，涉及了几种基本的生理过程，包括信号传导、细胞骨架重塑等。既往有研究显示［11］钙蛋白酶与Caspase 家族可共同致肿瘤细胞凋亡；在一些报道中指出［12］在肾癌中钙蛋白酶-1 的高表达提示患者预后不良；在黑色素瘤中钙蛋白酶-1 参与了MAPK 依赖性p27Kip1 的调节［13］，基于这些研究，钙蛋白酶-1 可能起肿瘤促进剂的作用。但关于钙蛋白酶-1 在结直肠癌疾病进展中作用的报道较少。

表1 两组患者一般资料比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of general information of the two groups of patients［n（%），（±s）］

表1 两组患者一般资料比较［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of general information of the two groups of patients［n（%），（±s）］

因素年龄（岁）性别（男/女）肿瘤部位乙状结肠直肠其他T 分期T2 T3 T4 N 分期N0 N1 N2 M 分期M0 M1肿瘤分化程度低分化中分化高分化钙蛋白酶-1 表达淋巴转移进展组（n=36）65.96±8.54 19/17无进展组（n=68）67.30±8.66 29/39 Z/t/χ2值0.758 0.972 P 值0.451 0.324 16（44.44）13（36.11）7（19.44）6（16.67）20（55.56）10（27.78）26（38.24）27（39.71）15（22.06）22（32.35）37（54.41）9（12.24）0.542 0.588 1.970 0.049 11（30.56）12（33.33）13（36.11）10（27.78）26（72.22）18（26.47）23（33.82）27（39.71）0.429 0.668 29（42.65）39（57.35）2.221 0.136 13（36.11）16（44.44）7（19.44）0.90±0.12 25（36.76）26（38.24）17（25.00）0.81±0.10 0.254 0.799 3.848＜0.001是否26（72.22）10（27.78）30（44.42）38（55.88）7.481 0.006术后化疗方案5-FU/LV卡培他滨FOLFOX FLOX CapeOx 10（27.78）15（38.89）2（5.56）3（8.33）6（16.67）19（27.94）17（25.00）7（10.29）9（13.24）16（23.53）0.937 0.349

图2 钙蛋白酶-1 与结直肠癌疾病进展的关系Figure 2 The relationship between calpain-1 and the progression of colorectal cancer

钙蛋白酶-1 基因位于染色体11q13，编码714个氨基酸。水解底物主要包括特定的蛋白和酶，如细胞骨架、肌原纤维蛋白和凋亡相关蛋白、信号调控激酶、转录因子等，其中肿瘤抑制蛋白P53、蛋白激酶C 等均参与了多种肿瘤的形成过程。在乳腺癌、消化系统癌症等多种癌症中均发现钙蛋白酶家族成员高表达［14］；在肝癌、胰腺癌中高表达可致正常细胞癌变或导致癌细胞转移［15］。目前临床上尚无确切证据证实钙蛋白酶-1 可直接促进癌症发展，但大量研究表明［16］钙蛋白酶-1 可水解肌原纤维、细胞骨架等来参与细胞凋亡、迁移等生理病理活动中。细胞的凋亡和增生是维持机体正常的前提，细胞无限制增生是恶性肿瘤发生的重要因素，钙蛋白酶-1 可通过水解IκBα 促进由NF-κB 介导的细胞存活。

在已有的文献报道中均指出［17］钙蛋白酶-1 的表达水平与癌细胞的转移呈明显正相关，结直肠癌术后疾病进展与转移密切相关。结直肠癌发展至晚期时易出现淋巴转移，癌肿侵入肠壁肌层后淋巴转移的机率增加，当癌肿浸润至肠壁深部淋巴管时，淋巴管内的癌细胞或瘤栓随淋巴液离开原发灶，形成新的癌灶向远处转移［18］。上皮间质转化是肿瘤侵袭转移的重要机制，上皮间质转化可使不具备远处转移潜能的肿瘤细胞形成远处转移灶。上皮间质转化过程常伴E-cadherin 的缺失或下调，E-cadherin 可维持细胞骨架稳定，介导细胞间连接，表达缺失可致细胞间黏附力下降。钙蛋白酶-1 还可活化基质金属蛋白酶，诱导细胞外基质重构和肿瘤细胞的迁移。钙蛋白酶-1 可通过水解细胞骨架增加细胞迁移速度，通过结合整联蛋白相关粘着斑，水解粘着斑裸蛋白减弱细胞间粘附力，从而促进肿瘤侵袭转移，进而促进疾病进展。

综上所述，钙蛋白酶-1 在疾病进展患者中高表达，可作为预测结直肠癌患者疾病进展风险的标志物。但其促进结直肠癌疾病进展的具体分子机制尚未明确，后期仍需通过RNA 干扰技术等调控钙蛋白酶-1 的表达，观察钙蛋白酶-1 对结直肠癌细胞行为的影响，进一步研究钙蛋白酶-1 在结直肠癌疾病进展机制中的作用。

表2 多因素Logistic 分析结果Table 2 Multi-factor Logistic analysis results

图3 钙蛋白酶-1 预测结直肠癌疾病进展风险的ROC 曲线Figure 3 The ROC curve of calpain-1 for predicting the risk of colorectal cancer disease progression

表3 钙蛋白酶-1 预测结直肠癌疾病进展风险的效能（%）Table 3 The efficacy of calpain-1 in predicting the risk of colorectal cancer disease progression（%）