香溪河库湾浮游细菌和病毒计数方法比较研究

程斯婷 赵以军 廖明军

（湖北工业大学资源与环境工程学院河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室，湖北武汉 430068）

1 引言

浮游细菌是水生态系统中的次级生产力，在浮游微生物食物网中扮演不可或缺的角色［1］。浮游病毒是水生态系统中最丰富的一种生物，能裂解宿主、控制宿主数量以及调节宿主的群落结构组成，介导基因的水平转移，对于种群的遗传物质、生态系统功能以及生物地球化学循环都有重要影响［2］。因此，对浮游细菌和病毒的准确快速计数对于研究水生生态学非常重要。目前，使用较多的计数方法有荧光显微镜计数法（EFM）和流式细胞仪计数法（FCM）等，前者对水样保存条件要求简单，可在-20 ℃保存2 周以上［3-4］，计数结果准确率较高，但是计数所需时间较长，效率相对较低；后者计数快速，准确性高，广泛应用于生物细胞、浮游植物、细菌和病毒［5-8］。尽管FCM结果明显，但样品保藏不当极易造成计数结果误差偏大，甚至造成结果偏低50%～80%［9］。目前FCM 计数样品保藏多采用Brussaard 等人提出的方法［9］，即新鲜样品添加终浓度为0.5%的戊二醛固定15～30 min 后，在液氮下速冻，然后放入-80 ℃冰箱长期保存。Brussaard 等人证实-80 ℃低温保藏前的液氮速冻能够保证所有被测样品计数结果的稳定性，但其结果也同时显示在没有液氮前处理的情况下，仍然有部分比例的样品（3/7）经-80 ℃长期保藏而计数结果没有明显下降［9］。这提示适用于FCM 的病毒样品保藏方法还有进一步细化探讨的空间，不同环境来源的样品所适用的保藏条件可进一步研究确定，特别是对于保藏条件受限的野外样品而言，研究合适有效的保存条件对于确保实验结果的可靠性至关重要。

本文以三峡水库香溪河库湾水样为检测对象，以EFM 为参照，研究了改变样品保存温度情况下利用FCM 计数浮游病毒和浮游细菌的可能性，为丰富淡水浮游微生物计数方法提供支持。

2 材料与方法

2.1 实验材料与保存方法

2019 年2 月25 日至2019 年3 月19 日期间采集了香溪河库湾的表层水样（XK：110°47′32.4″E，31°07′21.3″N；SY：110°45′41.5″E，30°58′2.1″N；XY：110°46′3.4″E，30°57′36.1″N；00：110°46′25.9″E，30°58′43.1″N；01：110°46′26.5″E，31°00′4.6″N；02：110°45′44.6″E，31°01′29.7″N；03：110°45′41.5″E，31°03′19.3″N；04：110°45′43.1″E，31°03′32.9″N；06：110°47′26.5″E，31°08′2.6″N；07：110°46′50.3″E，31°09′23.6″N；08：110°46′54.9″E，31°10′12.1″N）。

样品采集后添加戊二醛至终浓度为0.5%进行固定，并迅速放入-20 ℃暂存2 周，之后转入-80 ℃长期保存，计数前将样品于37 ℃下解冻。

2.2 主要仪器和试剂

仪器：生物显微镜（Leica DM4000B）；流式细胞仪（BD FACSCaliburTMFlow Cytometer）。

试剂：SYBR Gold、SYBR Green I、PBS、对苯二胺、甘油、Tris EDTA 缓冲液、鞘液。

2.3 方法

使用流式细胞仪对浮游细菌和病毒的计数操作方法如下［10］：由于流式细胞仪检测样品适宜丰度为105～106个/mL，检测浮游细菌丰度的样品可不经过稀释，检测浮游病毒丰度的样品需适当稀释。对于浮游细菌的检测，黑暗下加入SYBR Green I 至终浓度为1 ∶100 00，在40 ℃的水浴锅中避光加热10 min，待冷却至室温时上样于流式细胞仪中检测。检测浮游病毒时，用经过0.02 μm 过滤器的Tris EDTA 缓冲液（pH 约为8.0）对样品进行稀释（稀释倍数为10 或50 倍），稀释后添加SYBR Green I 至终浓度为1 ∶200 00，在水浴锅中80 ℃下避光加热10 min，待其冷却至室温时上样检测。

使用荧光显微镜对浮游细菌和病毒的计数操作方法如下［11］：取适当稀释的样品1 mL，加入荧光染料SYBR Gold（终浓度为0.25%），避光染色15 min后用孔径为0.02 μm、直径为13 mm 的氧化铝滤膜（Whatman Anodisc）过滤，然后向滤膜上滴加1 滴抗褪色剂（1∶1 体积比甘油-PBS 溶液中添加0.1%质量含量对苯二胺配置而成），制片后在10×100 倍的油镜下利用蓝色激发光观察，根据荧光强度、颗粒大小区分细菌与病毒，随机计数5 个视野中不同颗粒的数量，计数结果取平均值后根据稀释倍数、视野面积、过滤面积计算浮游细菌与病毒的丰度，计算公式如下：

式中，A 为浮游细菌或病毒的丰度，个/mL；n 为单个显微视野中浮游细菌或病毒的平均数量，个；Sm为滤膜面积，mm2；Sf为显微视野面积，mm2；d为计数样品的稀释倍数，倍。

2.4 数据处理与分析方法

采用SPSS V.21 统计分析软件，针对样品中浮游细菌与病毒丰度的EFM 和FCM 检测数据，利用Wilcoxon signed-rank 检验方法来观察2 种方法的计数有无差异，P＜0.05 时差异具有统计学意义。

3 结果

分别用荧光显微镜和流式细胞仪计数浮游细菌和病毒丰度，结果见表1。

表1 EFM 与FCM 计数浮游细菌和病毒丰度结果 个/mL

由表1 可知，EFM 与FCM 计数的浮游细菌丰度分别为（0.08～2.19）×106个/mL 和（0.16～4.10）×106个/mL，均值分别为（0.98±0.10）×106个/mL 和（0.85±0.13）×106个/mL；EFM 与FCM 计数的浮游病毒丰度分别为（0.13～3.04）×107个/mL 和（0.04～6.02）×107个/mL，均值分别为（1.09±0.16）×107个/mL 和（2.40±0.37）×107个/mL。

2 种方法对浮游细菌计数的Wilcoxon signedrank 检验结果中，Z=-1.842，P=0.065，认为FCM 与EFM 对于香溪河水样中浮游细菌的计数差异无统计学意义；而对浮游病毒计数的Wilcoxon signed-rank检验结果中Z=-4.704，P=0.000，认为FCM 与EFM对于香溪河浮游病毒的计数差异具有统计学意义，表明用FCM 进行香溪河水样中浮游病毒的计数结果比EFM 显著偏高，具体见表2。

表2 EFM 与FCM 分别对浮游细菌和病毒计数的Wilcoxon 检验结果

利用Pearson 相关性分析可知，EFM 和FCM 法对病毒的计数结果具有极显著正相关性（r=0.979，P＜0.01），见表3。

表3 EFM 与FCM 计数浮游病毒的Pearson 相关系数

4 讨论

EFM 和FCM 用于计数香溪河样品中浮游细菌丰度时结果相近，差异无统计学意义（P＞0.05）。2 种计数方法使用的染料对染色效率的差异影响不大，SYBR Green Ⅰ与SYBR Gold 染色效率大致相同［12］。有研究显示，SYBR Green Ⅰ在FCM 中相比SYBR Gold 更具有优势，但在显微镜下长时间激发会在亮度和持续荧光方面有不利影响［4］。另外，多数细菌粒径处于正常范围内，荧光信号较强，易辨认，使2 种方法的计数细菌丰度结果没有显著差异。误差存在的主要原因可能来源于操作者造成的差异［13］，因为天然水样中浮游细菌群落较复杂，荧光颗粒大小与强弱的界限不够明晰，存在部分粒径较小荧光微弱的细菌颗粒，导致计数偏差，人为计数差异一般在5%～20%内［14］。

对香溪河样品中浮游病毒计数时，EFM 和FCM计数的结果差异具有统计学意义，FCM 计数结果高于EFM（P＜0.01）。不同计数病毒的方法之间具有差异，通常有一种方法会产生较高病毒丰度的结果［15］。以往研究中检测自然水体的病毒丰度会出现FCM计数相对EFM 偏高的结果，如Marie 等［16］对自然水体如地中海和太平洋水样的病毒计数结果显示，FCM 计数相较于EFM 计数高达1.5 倍；Chen 等［17］对沿海和湖泊水样的病毒计数结果显示，FCM 比EFM 计数高达1.3 倍。本研究中FCM 计数病毒丰度比EFM 高0.2～3.1 倍（平均值为2.0±0.1 倍），与上述研究基本接近，说明本研究中FCM 计数结果可信。FCM 计数病毒丰度显著高于EFM，可从2 个角度解释原因：一是在EFM 中利用显微镜照片计数时，由于病毒未处于完全相同的焦点平面下，可能会存在失焦的病毒不可见导致计数偏低［4］；二是FCM 计数中在添加染料SYBR Green I 后于80 ℃的高温下加热，热处理可能会令病毒衣壳变性使染料渗透，染色的病毒百分比增加［16］。对FCM 和EFM 的病毒计数结果分析显示，两者具有强正相关性，表明FCM 能够稳定计数温和冷冻香溪河库湾样品中的浮游病毒。

本研究中样品采用温和冷冻的方式保存，没有用到液氮速冻，但FCM 计数结果并未出现病毒丰度下降50%～80%的现象［9］。这表明在FCM 计数浮游病毒方法中，液氮速冻并非所有环境样品保存的必须条件，这对条件有限的实验室开展浮游病毒研究意义重大。

5 结论

FCM 与EFM 计数温和冷冻香溪河样品中浮游细菌丰度的结果没有显著差异；FCM 计数温和冷冻香溪河样品中浮游病毒丰度的结果比EFM 获得的结果高2.0±0.1 倍，并未出现病毒丰度下降50%～80%的现象。上述结果证实，FCM 计数温和冷冻香溪河样品中浮游细菌和浮游病毒丰度结果可靠，液氮冷冻并非FCM 计数浮游病毒和浮游细菌丰度的必须条件。研究结果拓宽了利用FCM 计数香溪河浮游微生物的环境条件范围。